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试析病毒猪源牛病毒性腹泻病毒SDO803株细胞传代毕业论文格式

摘要:牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV)主要感染反刍动物,在90年代中期,我国开始发现猪群中有着牛病毒性腹泻病毒。目前对该病毒的深入探讨比较少,致病机理还不是很清楚,其对猪群的危害也不明确。本探讨中,通过采取套式聚合酶链式反应(Nested-PCR)策略,对2011年以山东、浙江、安徽、广西、江苏、天津、湖北和上海8省市收集样品以及我国部分厂家所生产的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪瘟活疫苗和猪伪狂犬病活疫苗进行了BVDV检测。结果显示,病料中牛病毒性腹泻病毒的总体检出率为12.04%(23/191),其中健康猪只中检出率为8.33%(8/106),发病猪样品中检出率为17.6%(15/85),商品疫苗检出率为33.3%(10/30)。这些结果表明我国疫苗污染牛病毒性腹泻病毒严重,接种污染牛病毒性腹泻病毒的疫苗可能是猪群感染牛病毒性腹泻病毒的主要途径之一。发病猪中的BVDV的感染率远比健康猪高,暗示着BVDV在猪病发生中可能起到一定的作用。将其中6份BVDV阳性样品进行克隆测序,运用生物信息学软件对所得毒株的5'-UTR核苷酸序进行了遗传进化浅析,结果表明,6株序列间核苷酸同源性在99.4%-100%之间,与其他参照株的核苷酸同源性在71.8%-95.8%之间。系统进化浅析显示克隆的所有送检阳性样品及商品化疫苗均为BVDV-1型,且均属于BVDV-1b亚型。这进一步表明猪群中感染BVDV可能来源于污染BVDV疫苗。为获得稳定的BVDV细胞传代株,对本实验室分离的BVDV毒株SD0803在马-达氏牛肾细胞(Mardin-Darby Bovine Kidney cell, MDBK)上连续传40代。通过反转录聚合酶链式反应(ReverseTranscription PCR, RT-PCR)和间接免疫荧光(Indirect Immunofluorescence, IFA)的策略检测到MDBK细胞中BVDV的E2基因片段和E2蛋白的表达,说明牛病毒性腹泻病毒在MDBK细胞中能够稳定传代。用反转录聚合酶链式反应策略分5段扩增和克隆第40代病毒基因片段,并进行全长测序,利用DNASTAR软件进行序列拼接及浅析,与亲代病毒SD0803序列比较浅析。结果表明,第40代病毒与亲代病毒核苷酸序列的同源性为99.8%,氨基酸序列的同源性为99.6%,其中有23处核苷酸发生碱基突变,其中15处为有义突变,氨基酸变化主要集中在E2和NS5B区域。为测定传代病毒的复制特性,将第1、10、20、30和40代病毒分别感染细胞,分时段收集病毒上清,抽提上清中的病毒RNA,用荧光定量PCR(Real-time Fluorescence Quantitative PCR, RTFQ PCR)策略测定RNA拷贝数,并绘制多步生长曲线。多步生长曲线显示,传代病毒和亲本病毒均能在MDBK细胞上获得较高的增殖效率,并有着相似的生长特性,但与亲代病毒相比,尽管传代病毒的基因组有一定的变异,但传代病毒在细胞上的增殖效率没有提升。亲本病毒和传代病毒均能在细胞中获得较高的增殖效率,说明传代后病毒适应了在MDBK细胞中复制。本次探讨为研制猪源牛病毒性腹泻病毒疫苗做好了物质储备,为下一步探讨其致病性和抗原性奠定基础。 关键词:猪源牛病毒性腹泻病毒论文 流行病学调查论文 病毒传代论文 荧光定量PCR论文 多步生长曲线论文
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    摘要6-7

    Abstract7-12

    第一章 前言12-21

    1.1 瘟病毒分类与历史起源12

    1.2 牛病毒性腹泻病原学12-14

    1.2.1 牛病毒性腹泻概况12-13

    1.2.2 牛病毒性腹泻病毒的分类地位13

    1.2.3 牛病毒性腹泻病毒粒子形态结构及理化特性13-14

    1.3 牛病毒性腹泻病毒分子生物学特点14-16

    1.3.1 牛病毒性腹泻病毒的基因组结构14-15

    1.3.2 病毒蛋白及功能15-16

    1.4 牛病毒性腹泻流行病学16-17

    1.4.1 流行历史、分布16

    1.4.2 传染源16

    1.4.3 传播媒介16-17

    1.4.4 易感动物和流行特点17

    1.4.5 分子流行病学特点17

    1.5 牛病毒性腹泻的临床体现和致病机理17-19

    1.5.1 持续性感染与免疫耐受17-18

    1.5.2 粘膜病与急性型BVD18

    1.5.3 免疫抑制

5.3 免疫抑制1 2 下一页

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