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简论质粒针对HIV-1vif基因的siRNA作用毕业论文网

摘要:艾滋病自80年代初在美国首次报道以来,以惊人的速度在全球蔓延,给人类社会造成了极大损失,对其进行预防和治疗已经成为刻不容缓的社会不足。目前广泛采取的高效抗逆转录病毒疗法,虽能够显著提升HIV-1感染者生活质量,但有着着价格昂贵,耐药和副作用的不足经常会导致治疗的中断。要获得长期持续的抗病毒治疗效果还有待于研发新的抗病****物和治疗策略。近年来随着分子生物学技术、干细胞探讨、纳米技术等相关技术的进展,关于抗HIV-1基因治疗策略的探讨受到了广泛关注,成为未来艾滋病治疗探讨的一个主要方向与技术手段。HIV-1病毒感染因子(viral infectivity factor, Vif)可显著增加病毒的感染力,在HIV-1感染和疾病进程中扮演着重要角色。本课题选择HIV-1vif基因作为靶点,采取RNA干扰技术抑制其表达,进而实现对HIV-1病毒感染的抑制作用。实验中针对HIV-1vif基因的不同位点构建了7条shRNA的表达载体,与vif基因的表达载体共转染于293FT细胞,Western Blot和Real-timePCR探讨表明shRNA7和shRNA10对HIV-1vif基因的表达有干扰作用。将shRNA7或shRNA10表达质粒、APOBEC3G表达质粒和病毒包装质粒共同转染到产毒细胞293FT中,p24定量结果表明shRNA对假病毒的包装没有影响。假病毒感染实验表明,当shRNA7的转染量为0.5g时,shRNA7对假病毒产生蓝斑的抑制率可达到52.93%,而当shRNA7的转染量增大到1.5g时对假病毒的抑制能力升高,可达到89.45%。shRNA10的抗HIV-1活性次之,1.5g时对HIV-1的抑制率为48.95%。 关键词:人类免疫缺陷病毒-1型论文 病毒感染因子论文 RNA干扰论文 小干扰论文 短发夹RNA论文
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    摘要4-5

    Abstract5-6

    英文缩写词6-11

    第1章 绪论11-21

    1.1 艾滋病及 HIV-1 病毒介绍11-13

    1.1.1 艾滋病及其流行情况11

    1.1.2 HIV-1 病毒的结构11-12

    1.1.3 HIV-1 病毒的生活周期12-13

    1.2 基于 RNA 的抗 HIV-1 基因治疗探讨进展13-17

    1.2.1 反义 RNA 在抗 HIV-1 基因治疗中的运用14

    1.2.2 核酶在抗 HIV-1 基因治疗中的运用14-15

    1.2.3 RNA 诱饵在抗 HIV-1 基因治疗中的运用15

    1.2.4 RNA 干扰及其在抗 HIV-1 基因治疗中的运用15-17

    1.3 HIV-1Vif 蛋白探讨进展17-19

    1.3.1 HIV-1 Vif 蛋白的结构17-18

    1.3.2 HIV-1 Vif 蛋白的生物学功能18-19

    1.4 探讨目的及内容19-20

    1.4.1 探讨目的19

    1.4.2 探讨内容19-20

    1.5 探讨技术路线20-21

    第2章 靶向 HIV-1 vif 基因的小干扰 RNA表达质粒的构建21-33

    2.1 实验材料21-22

    2.1.1 实验菌株与质粒21

    2.1.2 工具酶与试剂21

    2.1.3 小干扰 RNA 序列合成与测序21

    2.1.4 主要仪器21-22

    2.1.5 培养基与所需液体的配制22

    2.2 实验策略22-28

    2.2.1 针对 vif 基因的小干扰 RNA 表达质粒 pSUPER.neo.retro-shRNA 的构建22-26

    2.2.2 转化与菌落挑取26

    2.2.3 碱裂解法小提质粒26-27

    2.2.4 质粒的鉴定27

    2.2.5 中提质粒27-28

    2.2.6 质粒转染28

    2.3 实验结果28-30

    2.3.1 vif 基因特异性 pSUPER.neo.retro-shRNA 的构建28-30

    2.3.2 荧光显微镜间接检测 shRNA 的表达30

    2.4 讨论30-31

    2.5 本章小结31-33

    第3章 靶点特异性的 siRNA对 HIV-1 vif 基因表达的抑制作用33-49

    3.1 实验材料33-35

    3.1.1 细胞株和质粒33

    3.1.2 主要仪器33-34

    3.1.3 实验相关试剂34-35

    3.2 实验策略35-41

    3.2.1 细胞培养35

    3.2.2 细胞转染35-36

    3.2.3 Western Blot 检测36-38

    3.2.4 Real-time PCR38-40

    3.2.5 siRNA

章 靶点特异性的 siRNA对 HIV-1 vif 基因表达的抑制作用33-493.1 实验材料33-353.1.1 细胞株和质粒333.1.2 主要仪器33-343.1.3 实验相关试剂34-353.2 实验策略35-413.2.1 细胞培养353.2.2 细胞转染35-363.2.3 Western Blot 检测36-383.2.4 Real-time PCR38-403.2.5 siRNA1 2 下一页

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