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试析细胞精氨酸甲基化转移酶1对神经胶质瘤细胞生长的影响及作用机制标准论文
ting和Real-time PCR策略发现,相较于两例正常脑组织而言,PRMT1在4种人神经胶质瘤细胞系(T98G, U87MG, A172和U251)中蛋白表达显著增高,17例人神经胶质瘤组织(5例ⅡⅡ级,7例Ⅲ级,5例Ⅳ级)中13例样品的PRMT1蛋白表达量也高于正常脑组织。并且在神经胶质瘤细胞中PRMT1的mRNA水平也高于正常人类星形胶质细胞Heb的PRMT1mRNA水平。
摘要:探讨发现在所有已知物种中均有着蛋白翻译后修饰,它是指对新合成的多肽链或蛋白质进行的化学修饰以而调节蛋白质的功能(如定位、稳定性和特异性等)以及寿命。目前认为蛋白翻译后修饰主要包括磷酸化、乙酰化、羟化、甲基化、脂质化、以甲硫氨酸去除N-甲酰基、连接辅基以及泛素化等。在30年前,人们便发现蛋白甲基化是真核细胞中常见的翻译后修饰方式之一,主要包括精氨酸甲基化和赖氨酸甲基化。其中精氨酸甲基化主要是由精氨酸甲基化转移酶PRMT (protein arginine methyltransferase)家族催化形成,PRMT家族广泛有着于细胞核、细胞质以及细胞器中,并参与了翻译后修饰、转录后调控、RNA代谢和DNA损伤修复等历程。PRMT1是第一个被克隆出来的精氨酸甲基转移酶,并且探讨发现PRMT1的作用占据精氨酸甲基化转移酶家族催化活性的85%以上。PRMT1表达广泛,在几乎所有组织中均能检测到,并且在细胞核和细胞质中均有分布。已有文献报道PRMT1在多种肿瘤细胞系及组织中高表达,例如膀胱癌,胃癌,肺癌,白血病,睾丸癌,食道癌以及胰腺癌,并认为PRMT1在细胞周期、RNA加工历程以及DNA复制中起到重要作用,这提示PRMT1可能参与了人类癌症的发生。神经胶质瘤亦称胶质细胞瘤,为中枢神经系统常见,并发生于神经外胚层的肿瘤,是颅内最常见的肿瘤之一,并且其恶性程度较高。其发病率占颅内肿瘤的40-50%。根据肿瘤起源可分为,星形细胞瘤(astrocytoma)、胶质母细胞瘤(gpoblastoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、室管膜瘤(ependymoma)和少突胶质细胞瘤等。WHO根据其生物学行为分为Ⅰ-Ⅳ级,其中胶质母细胞瘤由于恶性程度高,在生物学行为分级中为IV级。尽管近年来在手术和放疗等技术上取得了很大的进步,但对神经胶质瘤的治疗,尤其是恶性程度高的胶质瘤的治疗,仍是目前困扰医学界的一大难题。统计学探讨表明胶质母细胞瘤患者即使手术、化疗和放疗的联合治疗后,其中位存活期仍仅为确诊后不到两年的时间。由此探讨神经胶质瘤的发病机制,寻找合适的药物治疗靶点对提升治疗效果和延长存活期具有重要的作用。神经胶质瘤甲基化的探讨主要集中于表观遗传学中DNA甲基化的影响,而在蛋白质肽链中精氨酸残基甲基化对神经胶质瘤发生进展中的作用探讨却相对匮乏。本探讨中,我们采取Western blotting和Real-time PCR策略发现,相较于两例正常脑组织而言,PRMT1在4种人神经胶质瘤细胞系(T98G, U87MG, A172和U251)中蛋白表达显著增高,17例人神经胶质瘤组织(5例ⅡⅡ级,7例Ⅲ级,5例Ⅳ级)中13例样品的PRMT1蛋白表达量也高于正常脑组织。并且在神经胶质瘤细胞中PRMT1的mRNA水平也高于正常人类星形胶质细胞Heb的PRMT1mRNA水平。同时,一例Ⅱ级神经胶质瘤患者的瘤及瘤旁组织中PRMT1免疫组化结果也显示神经胶质瘤组织中PRMT1蛋白表达量较瘤旁区域高。这在RNA水平及蛋白水平上均提示PRMT1在神经胶质瘤中mRNA及蛋白表达均显著增高,而PRMT1是一种精氨酸甲基化转移酶,那么PRMT1的表达增高势必会影响下游靶蛋白甲基化水平的变化,这种变化很可能参与并调控神经胶质瘤细胞的发生与进展。根据上面陈述的提示,本论文以细胞功能学方面探讨了PRMT1对神经胶质瘤生长、凋亡及迁移的影响,并利用质谱等策略筛选PRMT1可能作用的下游靶蛋白。首先,我们将针对PRMT1的特异StealthTM RNAi序列转染四种神经胶质瘤细胞,利用MTT、流式细胞浅析、TUNEL实验、细胞划痕实验、Transwell实验及裸鼠成瘤实验观察敲低PRMT1后对神经胶质瘤细胞生长、凋亡及迁移的影响。结果发现,PRMT1表达量降低后会引起神经胶质瘤细胞生长减缓,并且细胞发生凋亡的比例增加,细胞周期中G1期-S期受到阻滞,但对于细胞迁移无显著影响。之后利用针对不对称双甲基化精氨酸蛋白的特异性抗体ASYM24以及Histone H4的R3位点不对称双甲基化抗体H4R3diMe,我们发现神经胶质瘤细胞中大部分不对称双甲基化精氨酸水平以及PRMT1的下游靶蛋白Histone H4R3不对称双甲基化水平均较正常脑组织显著增高,其走势与PRMT1相似。之后,敲低PRMT1后细胞内不对称双甲基化精氨酸水平显著降低,Histone H4R3不对称双甲基化水平也显著下降。这说明PRMT1可能通过调控下游靶蛋白中精氨酸位点的不对称双甲基化以而对细胞生长进行调控。此外,我们利用免疫共沉淀、Western blotting和银染的策略,获得可与PRMT1结合且可能含有不对称双甲基化精氨酸的蛋白条带。通过质谱策略我们共获得26个候选蛋白。其中6个候选蛋白的蛋白可信度较高,并且生物信息学预测SEC23-IP, ANKHD1-EIF4EBP3protein和1-phosphatidypnositol-3-phosphate5-kinase isoform2可能含有可被甲基化的精氨酸位点。 关键词:PRMT1论文 Histone论文 H4R3论文 ADMA论文 神经胶质瘤论文 蛋白翻译后调控论文
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    摘要4-6

    Abstract6-9

    前言9-16

    实验材料16-22

    实验策略22-37

    实验结果37-62

    讨论62-66

    不足与展望66-68

    小结68-69

    参考文献69-77

    文献综述77-98

    参考文献87-98

    附录98-99

    个人简历99

    发表文章和会议摘要99-101

    致谢101-103

胶质母细胞瘤由于恶性程度高,在生物学行为分级中为IV级。尽管近年来在手术和放疗等技术上取得了很大的进步,但对神经胶质瘤的治疗,尤其是恶性程度高的胶质瘤的治疗,仍是目前困扰医学界的一大难题。统计学探讨表明胶质母细胞瘤患者即使手术、化疗和放疗的联合治疗后,其中位存活期仍仅为确诊后不到两年的时间。由此探讨神经胶质

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