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谈菌株甾醇酯酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质本科毕业论文范文

摘要:甾醇酯酶也称为胆固醇酯酶(EC3.1.1.13),它催化水解甾醇酯生成甾醇与脂肪酸,此前,甾醇酯酶主要与胆固醇氧化酶联合,运用于检测血液中总胆固醇的含量。近年来,甾醇酯酶的运用领域正在逐渐拓宽,有探讨报道,Ophiostoma piceae和Melanocarpusalbomyces的甾醇酯酶具有解决机械制浆造纸工艺中树脂障碍不足的潜力。目前,甾醇酯酶的来源有限,活性较低,离实际工业化运用还有一定的距离,所以需要对更多来源的甾醇酯酶进行探讨。设计了一种以植物甾醇酯为底物,罗丹明B为荧光指示剂的平板筛选策略,以土壤中筛选得到24株具有甾醇酯酶活性的菌株,其中编号为jx-39的菌株具有最高产酶活性,经16S rDNA鉴定表明菌株jx-39属于金黄杆菌属,命名为Chryseobacterium sp.jx-39。探讨了菌株Chryseobacterium sp.jx-39的摇瓶发酵产酶条件,得到初步优化的产酶培养基为(g/L):菜籽油2,牛肉膏5,K_2HPO_42,MgSO_47H_2O0.5,(NH_4)_2SO_41,葡萄糖10,pH7.0;优化的产酶培养条件为:装液量10%,接种量2%,培养温度30℃,摇床转速200rpm。在优化的产酶条件下,菌株jx-39培养18h产酶活性最高可达到0.194IU/mL。初步纯化了Chryseobacterium sp.jx-39的甾醇酯酶并探讨其部分酶学性质,该酶的酶促反应最适温度为40℃,最适pH为7.5,其在45℃以下,pH5.0-9.0具有较好的稳定性。该酶对不同碳链长度的脂肪酸胆固醇酯和对硝基苯酚酯具有广泛的底物特异性,显示该甾醇酯酶具有解决机械制浆造纸工艺中树脂障碍不足的潜力。 关键词:甾醇酯酶论文 Chryseobacterium论文 sp.论文 酶学性质论文
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    致谢3-4

    摘要4-5

    Abstract5-9

    第一章 绪论9-21

    1.1 甾醇酯酶9-14

    1.1.1 酯酶的标准分类9

    1.1.2 典型酯酶与脂肪酶的差别9-10

    1.1.3 甾醇酯酶的来源10-11

    1.1.4 酯酶的催化机制11

    1.1.5 甾醇酯酶的纯化11-12

    1.1.6 甾醇酯酶的底物特异性12-13

    1.1.7 甾醇酯酶的分子生物学探讨13-14

    1.2 造纸历程的树脂障碍及其危害14-16

    1.2.1 树脂的来源14-15

    1.2.2 树脂障碍的危害15-16

    1.3 树脂障碍的制约策略16-19

    1.3.1 化学法制约树脂障碍16-18

    1.3.2 工艺法制约树脂障碍18

    1.3.3 微生物制约树脂障碍18

    1.3.4 脂肪酶制约树脂障碍18-19

    1.4 甾醇酯酶的运用19-20

    1.4.1 胆固醇的检测19

    1.4.2 制浆造纸工业19

    1.4.3 日化工业19-20

    1.4.4 食品工业20

    1.4.5 聚氨酯的生物降解20

    1.5 探讨目的和作用20-21

    第二章 甾醇酯酶产生菌的筛选与鉴定21-32

    2.1 材料21-23

    2.1.1 样品21

    2.1.2 培养基21

    2.1.3 主要试剂21-22

    2.1.4 主要仪器22-23

    2.2 策略23-26

    2.2.1 菌株筛选策略23

    2.2.2 酶活检测策略23-24

    2.2.3 菌株的鉴定24-26

    2.3 结果与讨论26-31

    2.3.1 初筛平板的制作26

    2.3.2 菌株的筛选26-28

    2.3.3 菌株 jx-39 的鉴定28-31

    2.4 小结31-32

    第三章 jx-39 产甾醇酯酶发酵条件的优化探讨32-40

    3.1 材料32

    3.1.1 菌种32

    3.1.2 药品及试剂32

    3.1.3 培养基32

    3.1.4 主要仪器32

    3.2 策略32-34

    3.2.1 培养策略32

    3.2.2 酶活检测策略32-33

    3.2.3 产酶条件的初步优化33-34

    3.3 结果与讨论34-39

    3.3.1 起始 pH 值对产酶的影响34

    3.3.2 培养温度对产酶的影响34-35

    3.3.3 碳源对产酶的影响35

    3.3.4 氮源对产酶的影响35-36

    3.3.5 植物油脂对产酶的影响36

    3.3.6 菜籽油添加量对产酶的影响36-37

    3.3.7 装液量对产酶的影响37

    3.3.8 接种量对产酶的影响37-38

    3.3.9 产酶条件优化前后菌株产酶情况的比较38-39

    3.4 小结39-40

    第四章 甾醇酯酶的初步分离纯化40-47

    4.1 材料40

    4.1.1 菌株40

    4.1.2 主要试剂40

    4.1.3 主要溶液40

    4.1.4 主要仪器40

    4.2 策略40-44

    4.2.1 粗酶液的制备40

    4.2.2 硫酸铵沉淀40-41

    4.2.3 凝胶过滤脱盐柱脱盐41

    4.2.4 DEAE-sepharose Fast Flow 阴离子交换层析41

    4.2.5 超滤浓缩41

    4.2.6 HiLoad Superdex 75 凝胶过滤层析41

    4.2.7 酶活测定策略41-42

    4.2.8 蛋白质含量的检测策略42

    4.2.9 SDS-PAGE 电泳浅析42-44

    4.3 结果与讨论44-46

    4.3.1 HiPrepTM26/10Desalting 层析柱44

    4.3.2 DEAE-sepharose Fast Flow 阴离子交换层析44-45

    4.3.3 HiLoad Superdex 75 凝胶过滤层析45

    4.3.4 甾醇酯酶纯化结果及 SDS-PAGE 浅析45-46

    4.4 小结46-47

    第五章 甾醇酯酶酶学性质的探讨47-53

    5.1 材料47

    5.1.1 酶液的制备47

    5.1.2 主要试剂47

    5.1.3 主要仪器47

    5.2 策略47-48

    5.2.1 酶活检测策略47

    5.2.2 酶促反应最适 pH 和最适温度的确定47-48

    5.2.3 pH 耐受性和温度稳定性的确定48

    5.2.4 底物特异性48

    5.3 结果与讨论48-52

    5.3.1 最适反应温度和温度耐受性48-49

    5.3.2 最适反应 pH 和 pH 耐受性49-50

    5.3.3 甾醇酯酶的底物特异性50-52

    5.4 本章小结52-53

    第六章 总结与展望53-54

    参考文献54-58

    详细摘要58-61

障碍不足的潜力。目前,甾醇酯酶的来源有限,活性较低,离实际工业化运用还有一定的距离,所以需要对更多来源的甾醇酯酶进行探讨。设计了一种以植物甾醇酯为底物,罗丹明B为荧光指示剂的平板筛选策略,以土壤中筛选得到24株具有甾醇酯酶活性的菌株,其中编号为jx-39的菌株具有最高产酶活性,经16S rDNA鉴定表明菌株jx-39属于金黄杆菌

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