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试析核发半滑舌鳎性别决定机制证明及生长相关微卫星标记筛选研究生论文
231.4.4 单链构象多态性231.4.5 单核苷酸多态性231.5 本探讨的目的作用23-241.6 探讨内容24-252 材料与办法25-312.1 试验材料252.1.1 雌核发育的试验材料252.1.2 生长相关标记的试验材料252.2 实验仪器及试剂25-272.2.1 实验仪器设备25-262.2.2 实验试剂262.2.3 微卫1 2 下一页
摘要:半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是分布于我国沿岸的重要经济鱼类,它生长快,个体大,且味道鲜美,是目前海产养殖鱼类中单价最高的种类。半滑舌鳎雌性个体很大,但雄性个体很小,雌性比雄性生长速度快2-4倍,雄性个体成熟后也达不到商品规格,且雄性比例占大多数,所从,雄性个体不得不在养殖途中淘汰,给养殖者造成严重经济损失。近年,这一不足已经成为影响产业进展的重大渔业不足,而引起主管部门和科技工作者的普遍关注。本实验的目的是通过雌核发育诱导的办法生产全雌群体。诱导鱼类雌核发育是实现鱼类雌性化及探讨性别决定机制的有效办法,迄今,已有多种鱼类进行了这方面的试验探讨。现已知最常见的鱼类性别决定机制为XX-XY型和ZW-ZZ型。同样经雌核发育诱导后XX-XY型鱼类可得到全雌群体,而ZW-ZZ型鱼类雌雄个体各一半,正因为此了解半滑舌鳎的性别决定机制十分必要。同时如果半滑舌鳎是ZW-ZZ型性别决定机制,论述上来说诱导雌核发育后将会有WW型超雌鱼的出现,而超雌鱼能否生存,能发育到什么时期,有什么特点,都将是鱼类遗传和性别决定机制方面的重大突破。也将为从后的探讨提供基础。通过实验证明WW型“超雌鱼”能在囊胚期检测到却不能在肌节期检测到,进而推测出WW型“超雌鱼”在原肠期全部死亡的结论。这也就导致了不能通过诱导雌核发育的办法生产全雌群体。由此在生产中迫切需要半滑舌鳎良种的基础上,本论文开展了微卫星标记辅助育种的探讨。标记辅助选择育种(Marker-assisted selection,MAS)是在DNA水平上进行选择,可从大大提升选择的准确性,也是近年广泛使用的选育办法。本探讨采取冷冻鲈鱼 成功诱导半滑舌鳎雌核发育;用微卫星标记及染色体制片办法检测雌核发育后代的性别及比例;根据半滑舌鳎遗传连锁图谱设计引物,筛选与生长性状相关的微卫星标记。取得从下重要结果:1、使用冷冻鲈鱼 激活半滑舌鳎卵子,采取冷休克和静水压办法,成功诱导半滑舌鳎雌核发育,培育出减数分裂雌核发育个体,诱导出有丝分裂雌核发育胚胎。冷休克的最佳诱导条件为:起始时间(受精后)5min,持续时间25min,冷休克温度5℃。静水压的最佳诱导条件是:起始时间21.5min,持续时间4min,静水压力60MPa。2、使用性别特异性分子标记Cyse-SSR1检测雌核发育后代性别类型及性比,发现WW型胚胎仅出现于有丝分裂和减数分裂雌核发育的囊胚期,在而肌节期从后两种雌核发育都没有出现WW型胚胎,初步推断WW型“超雌鱼”个体在原肠期死亡。3、使用染色体核型检测雌核发育后代性别类型及性比。在半滑舌鳎的减数分裂和有丝分裂雌核发育组中均未发现有两条性别特异性染色体的WW型“超雌鱼”,也未发现有一条性别特异性染色体的ZW型雌性,而是全部为没有性别特异性染色体的ZZ型雄性。在对照组中未发现WW型“超雌鱼”,ZW型雌性与ZZ型雄性的比例接近1:1。以雌核发育后代的性比可从看出,半滑舌鳎雌核发育二倍体不是全雌性后代,由此可从判断,它不是雄性异配型性别决定机制,即非XX-XY型;雌核发育二倍体中未发现性别特异性大染色体,而是全部没有特异性染色体的ZZ型雄鱼,说明半滑舌鳎是一种特殊的雌性异配的性别决定机制。4、随机采集大小已分化半滑舌鳎200尾根据体重分为极端大群体和极端小群体。以卡方检验分析结果可从看出,在所选择的84个微卫星位点中,有12个微卫星位点的基因型分布,在极端大个体组和极端小个体组的差别趋近于明显(P0.05),其中csou34、ghrh-ssr、hncyse160差别极明显(P0.01), cs7、csou4、cyse22、cyse72、cyse123、sox9-1、hncse67、hncyse124、 hncyse129差别明显(P<0.05)。5、使用微卫星标记Cyse-SSRI、SCAR标记CseF382将验证群体分为45尾的雌性群体和51尾的雄性群体。使用最小二乘法对微卫星位点与半滑舌鳎全长、体高、体重性状进行关联性分析。在雌性群体中:微卫星位点csou4、cyse123、ghrh-ssr与全长明显相关(P0.05),cyse72、 hncyse160与全长极明显相关(P0.01);位点ghrh-ssr与体高明显相关(P0.05);位点csou4、 ghrh-ssr与体重明显相关,cyse72、hncyse160与体重极明显相关(P0.01)。在雄性群体中:位点hncyse129、hncyse160、sox9-1与全长明显相关:位点csou34、cyse22、cyse123、hncse67、 sox9-1与体高明显相关;未发现与体重明显或极明显相关的微卫星位点。6、对差别明显的位点进行不同基因型与生长性状的多重对比结果显示,在雌性群体中,全长、体高、体重性状的优势基因型为cs7位点的AA、csou4的AE、csou34的AA、cyse22的EF、cyse72的BC、cyse123的AB、hncse67的BC、hncyse124的AC、hncyse129的CC、 hncyse160的BB、ghrh-ssr的AE和sox9-1的AD。雄性群体内3个生长性状的优势基因型为cs7的AA、csou4的AC、csou34的EE、cyse22的CD、cyse72的BD、cyse123的AA、hncse67的AC、hncyse124的BC、hncyse129的CF、hncyse160的BB、ghrh-ssr的AC和sox9-1的AB。本探讨首次提出并验证WW型“超雌鱼”个体在原肠期死亡的结论,优化减数分裂及有丝分裂雌核发育参数,首次筛选出与体重生长明显或极明显相关的12个微卫星位点,在雌雄群体内分别筛选出与全长、体高、体重性状相关的优势基因型。 关键词:半滑舌鳎论文 雌核发育论文 性比论文 微卫星论文 相关分析论文 生长性状论文
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    摘要8-10

    Abstract10-12

    1 引言12-25

    1.1 半滑舌鳎的生物学特性12-13

    1.1.1 分类、分布与形态特点12

    1.1.2 生态习性12-13

    1.1.3 繁殖习性13

    1.2 鱼类的雌核发育13-19

    1.2.1 天然雌核发育13-14

    1.2.2 人工雌核发育14-16

    1.2.3 人工雌核发育在水产中的运用16-19

    1.3 染色体探讨19-21

    1.3.1 染色体19

    1.3.2 染色体的制备办法19-21

    1.4 水产动物分子遗传学标记辅助育种技术探讨发展21-23

    1.4.1 限制性片段长度多态性21-22

    1.4.2 扩增片段长度多态性22

    1.4.3 微卫星DNA22-23

    1.4.4 单链构象多态性23

    1.4.5 单核苷酸多态性23

    1.5 本探讨的目的作用23-24

    1.6 探讨内容24-25

    2 材料与办法25-31

    2.1 试验材料25

    2.1.1 雌核发育的试验材料25

    2.1.2 生长相关标记的试验材料25

    2.2 实验仪器及试剂25-27

    2.2.1 实验仪器设备25-26

    2.2.2 实验试剂26

    2.2.3 微卫

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