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阐释卵壳家蚕内层卵壳蛋白及蚕卵致死突变体(l-e~m)突变机理毕业论文提纲范文

摘要:卵子发生历程是昆虫繁衍及种群维持的关键生理历程。昆虫卵子发生将依次经历前卵黄生成期、卵黄生成期、卵壳生成期、及排卵和受精期等发育阶段。昆虫卵壳主要成分为蛋白质,由卵巢组织中的特殊分泌型细胞—滤泡上皮细胞,于卵壳生成期分泌附着在卵细胞表面的一个复杂胞外结构层。昆虫卵壳包括外层卵壳层和内层卵壳层(也称为卵黄膜层)两个主要的结构层,行使保护胚胎免受机械损伤和微生物侵染、防止水分丧失、维持气体交换、参与胚胎极性形成等重要功能。卵壳结构极为功能是昆虫生物学探讨的热点之一。昆虫间卵壳蛋白的差别性,使得卵黄膜层结构蛋白(也称为卵黄膜蛋白)的探讨长期局限于双翅目昆虫中,这种探讨状态与卵壳多样性及生理功能重要量不相匹配。此外,昆虫胞外卵壳结构层的分泌组装历程;不同昆虫卵黄膜蛋白的构成、序列特点、序列的保守性及差别性;卵黄膜蛋白编码基因的表达特点、编码基因在基因组中的分布特点等都是一系列未知的生物学不足。本探讨从鳞翅目方式昆虫-家蚕为探讨对象,构建家蚕卵巢及蚕卵蛋白质图谱,通过对比蛋白质组学技术,分析卵子发生历程中卵巢及蚕卵的蛋白质组成及变化状况,鉴定获取发育时期相关的特点蛋白质。筛选家蚕极为它鳞翅目昆虫卵黄膜蛋白极为编码基因,对比分析不同昆虫卵黄膜蛋白序列的保守性与差别性,并从家蚕卵黄膜蛋白-BmEP80为代表,结合相应的蚕卵致死突变体(ι-em),对鳞翅目昆虫卵黄膜蛋白进行功能探讨。主要获得如下探讨结果:1、家蚕蚕卵和卵巢组织蛋白质组学分析昆虫卵子发生的基本功能单元为滤泡。在家蚕中,滤泡发育主要在蛹期完成,家蚕滤泡发育具有典型的次序性(也称为不同步性),即卵巢管中依次排列着不同发育阶段的滤泡,相邻滤泡发育间隔2-2.5h。本探讨获取家蚕Dazao (野生型)化蛹7天卵巢组织、Dazao24h和48h受精卵、Dazao24h和48h非受精卵、滞育性Dazao受精卵、非滞育性Dazao受精卵、Dazao蚕卵卵壳、Dazao蚕卵内容物、从及家蚕小卵突变种(emi、sm、sm-2)化蛹7天卵巢组织,抽提蛋白质,经双向电泳分析,获取相应的双向电泳图谱。选取Dazao化蛹7天卵巢组织及Dazao24h受精卵的蛋白质双向电泳图谱,挖取丰度较高的蛋白点,经MALDI-TOF-MS鉴定分析,分别鉴定获得33和42个不同的蛋白质,构建了家蚕蛹期卵巢组织及家蚕早期胚胎期蚕卵的蛋白质图谱。对比蛋白质组学分析Dazao24h和48h受精卵、及24h和48h非受精卵卵蛋白的双向电泳图谱,获得与蚕卵受精及早期胚胎发育相关的5个特点蛋白点,经MALDI-TOF-MS鉴定发现,其中两个特点蛋白质为本探讨在家蚕中首次鉴定获得,分别命名为BmEP80和Peritrophin-pke27。 BmEP80合成于家蚕蛹期卵巢组织,之后存储于蚕卵中,蚕卵受精后BmEP80将消失。基于上面陈述的特点,推测BmEP80为家蚕内层卵壳结构蛋白。Peritrophin-pke27含有三个Chitin binding Peritrophin-A结构域,于蚕卵受精48h后出现。推测家蚕早期胚子形成历程中,Peritrophin-pke27可能作为一个结构蛋白参与某一组织或器官的形成。本探讨通过对比蛋白质组学分析,获得滞育性受精卵与非滞育性受精卵卵蛋白的差别蛋白点,从及家蚕Dazao与家蚕小卵突变种卵巢组织蛋白质的差别蛋白点。上面陈述的差别蛋白质的鉴定与分析,对家蚕蚕卵滞育的形成从及家蚕小卵突变的探讨提供了几点参考数据。2、家蚕BmEP80表达特点及功能探讨家蚕蚕卵对比蛋白质组学分析显示,BmEP80疑似为家蚕内层卵壳蛋白,基因组基因预测信息显示BmEP80为单外显子基因编码的大分子量蛋白质。本探讨对BmEP80极为编码基因的表达方式和功能开展相关分析。基因表达特点显示:BmEP80特异表达于家蚕蛹中后期的卵巢组织;不同发育时期滤泡检测结果显示,BmEP80表达于卵黄生成期后期至卵壳生成期早期的滤泡中,高量表达区间为-5~+10;原位杂交结果显示,BmEP80由滤泡上皮细胞所表达,卵细胞不表达BmEP80。Western blot检测蛋白表达特点显示,BmEP80开启表达于--10期滤泡;蚕卵不同组分蛋白质双向电泳分析显示,蚕卵中的BmEP80分布于卵壳结构中,而蚕卵内容物无此蛋白;家蚕蚕卵卵壳免疫组化检测结果显示,BmEP80定位于一个狭窄的卵壳结构层中,该结构层位于小脊柱层和卵黄膜层之间。上面陈述的结果证实BmEP80为家蚕一个大分子量内层卵壳蛋白编码基因,BmEP80基因及蛋白的表达方式均符合昆虫内层卵壳蛋白的特点。本探讨利用RNA干涉办法探讨家蚕BmEP80的功能,BmEP80siRNAs注射干涉后,蛹期卵巢组织中该基因表达受到瞬时抑制,相应蚕卵卵壳中BmEP80蛋白含量下降约20%。BmEP80RNA干涉不影响滤泡后续发育历程,从及个体化蛾、交配产卵行为。卵壳中BmEP80降低使得蚕卵在胚胎发育历程中发生三角形凹陷,表明BmEP80作为家蚕内层卵壳层的一个结构蛋白,行使维持卵壳结构完整的功能,并且推测与蚕卵卵壳保水功能相关。3、鳞翅目昆虫卵黄膜蛋白编码基因预测、表达特点及功能域分析昆虫卵黄膜蛋白的探讨局限于双翅目昆虫。双翅目昆虫之外,仅在家蚕中鉴定报道过一个卵黄膜蛋白-BmVMP30。序列比对分析显示BmVMP30与双翅目昆虫卵黄膜蛋白不有着序列相似性。黑腹果蝇卵黄膜蛋白编码基因(VM26Ab, VM26Ac和VM26Aa)戎簇分布于2号染色体左臂26A位点处,基于对此特点的深思,本探讨在BmEP80侧翼基因组序列上鉴定出3个预测卵黄膜蛋白编码基因,表明家蚕基因组中也有着类似的卵黄膜蛋白编码区。该区域中预测卵黄膜蛋白编码基因依次命名为:BmVMP25(-)、 BmVMP23(+)、BmEP80(+)、BmVMP30.1(+)。基因表达特点分析结果显示,BmVMP25、BmVMP23及BmVMP30.1均体现为蛹期卵巢组织特异表达,并且表达于卵壳生成期早期之前的滤泡。预测基因的表达方式符合昆虫卵黄膜蛋白编码基因的表达特点。烟草天蛾、帝王蝶、红带袖蝶基因组测序公布后,本探讨进行tBlastn检索分析,发现已测序鳞翅目昆虫基因组中均有着卵黄膜蛋白编码区域,编码区域内分别鉴定到卵黄膜蛋白编码基因4个、3个和4个,并且基因排列模式相一致,即第一个预测基因由负义链编码,之后预测基因由正义链编码。本探讨揭示卵黄膜蛋白编码基因成簇排布特点在鳞翅目昆虫和双翅目昆虫间是保守的。基于序列差别性,本探讨将己鉴定鳞翅目昆虫卵黄膜蛋白分为三类:Group Ⅰ-Ⅲ。Group Ⅰ中的卵黄膜蛋白C末端有着一个保守的疏水性基序(35aa),将其命名为VM结构域。鳞翅目昆虫VM结构域有着两个保守的半胱氨酸残基(CX7C),并且半胱氨酸残基处有着非经典氧化还原位点(CXXS、SXXC).本探讨首次证明VM结构域在昆虫间的保守性,推测昆虫内层卵壳结构层在组装形式上有着一致性,即通过分子间二硫键进行交联组装。鳞翅目与双翅目昆虫VM结构域序列比对分析显示,2号位半胱氨酸残基高度保守,1号位半胱氨酸残基保守性次之,双翅目昆虫VM结构域中3号位半胱氨酸残基在鳞翅目昆虫VM结构域中不有着。推测昆

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