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探索固定磁性纳米颗粒定向固定化脂肪酶及其运用硕士论文
1 全文总结129-1308.2 展望130-132致谢132-133参考文献133-156附录1 攻读学位期间发表论文目录156-158附录2 各种仪器和设备158              
摘要:磁性纳米颗粒具有比表面积大、可均匀分散于反应系统、表面易修饰为各种不同活性基团等优点,从其为载体固定化的酶在反应系统中几乎不有着传质阻力,且能够非常容易地在外加磁场意义下分离回收从重复利用,以而大大降低酶的利用成本。其中磁性纳米颗粒共价交联固定化酶稳定性最佳。但传统的共价固定化载体多随机与酶分子上的活性基团共价交联,这可能导致底物进入酶活性位点的通道被阻塞,或形成多位点结合,更甚者,当共价结合位点在酶催化活性中心附近时,会造成酶活性构象发生不可逆的转变,导致酶活大幅降低。为此,本论文通过生物信息学分析获知酶的结构信息,从此为基础,开发简便易行的定向固定化办法。针对不同酶种采取不同固定化系统,并首次利用反胶束固定化系统,获得了高催化性能的固定化酶。同时也为其它酶种的定向固定化提供有益借鉴。本论文从自制Fe304磁性纳米颗粒(MNPs)为载体,定向固定化解脂耶氏酵母(Yarrowia ppolytica)脂肪酶LIP2(YLLIP2)和洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶(BCL),并进行了运用探索,主要探讨内容及结果摘要如下:1.通过化学共沉淀法了制备了MNPs,并从(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)包覆其表面,得到带-NH2功能化的A-MNPs。采取XRD和FT-IR对其进行表征,XRD图谱证实所得磁性纳米颗粒为Fe3O4MNPs,且Fe304晶相呈现出反尖晶石型,不含其它杂相,说明制备的磁性纳米晶纯度极高。FT-IR检测结果表明,APTES成功实现了对MNPs的包覆。所制备的磁性纳米颗粒MNPs、A-MNPs粒径分别为17.2nm和18.4nm。2.通过分析YLLIP2和BCL一级结构,获知了两种酶蛋白的氨基酸组成及带不同活性基团的氨基酸残基含量。应用Rasmol软件进一步分析了两种酶的三维构象,探讨酶蛋白中的游离ε-NH2、-COOH、-OH、-SH在其分子上的分布。结果显示,两种酶的游离ε-NH2在酶分子上呈现区域化分布,距离酶的催化活性中心均较远,而其它活性基团则相对均一地分布在酶分子上。为此,选择游离氨基作为共价固定结合点,从定向固定化YLLIP2和BCL。在此基础上,结合固定化载体性质,拟定了分别通过酶蛋白上的游离ε-NH2和-COOH为共价结合点的两种不同固定化对策,实现酶的固定化。结果表明:YLLIP2通过酶上游离氨基和羧基固定化,固定化酶蛋白比活力分别为游离酶的36.9%、17.3%;而BCL通过酶上游离氨基和羧基固定化,固定化酶蛋白比活力分别为游离酶的128.2%和94.6%。验证了生物信息学分析的结论。3.确定从游离氨基为共价固定结合点后,从醛基活化的A-MNPs (G-MNPs)为载体,在水相 价固定化YLLIP2和BCL,并对其固定化条件进行了单因素优化。结果表明,两种酶在水相固定化系统中,固定化率均较高,可达85%从上。在最优条件下,水相固定化YLLIP2的水解酶活回收率为42.4%;而BCL在固定化系统中有着甘油酯作为激活剂和保护剂的条件下,固定化酶活力得到大幅度提升,其酯化酶活回收率高达1081.9%。4.从G-MNPs为固定化载体,首次在反胶束固定化系统中实现了对YLLIP2和BCL的定向共价固定化。YLLIP2在Span20反胶束系统中定向固定化后,水解酶活回收率可达540.2%。优化条件为表面活性剂Span20, W0=1.12,正己醇为助表面活性剂且Z=2.26时,酶活回收率进一步提升到1466.1%。同样,BCL在AOT反胶束固定化系统,W0=10,正丁醇为助表面活性剂且Z=2时,其酯化酶活回收率可达989.5%。5.探讨了固定化YLLIP2和BCL的酶学性质。固定化YLLIP2的最适温度为30℃,较游离酶提升5℃,最适pH为8.0,与游离酶保持一致;其温度稳定性有了大幅提升,40℃下孵育1小时,固定化YLLIP2的残余酶活保留61.8%,而游离YLLIP2仅为34.3%;pH稳定性也得到大幅增强,pH7.5下孵育1小时,固定化YLLIP2残余活力为81.5%,而游离YLLIP2仅有36.4%。固定化BCL的最适温度为45℃,比游离BCL提升5℃,最适pH为7.0,与游离酶一致;其温度稳定性提升明显,65℃下孵育1小时,固定化BCL的残余活力高达82.4%,而游离BCL的仅为28.9%;其pH稳定性在游离酶拥有的良好耐受性的基础上又有所提升。6.从固定化YLLIP2为催化剂,催化鱼油水解从富集DHA制备功能性油脂。结果表明,反应12h,其水解度及DHA含量达到40.2%和36.8%,相对的游离酶水解度和DHA仅为27.3%和31.6%。制备的功能性油酯DHA含量较初始鱼油提升了90%。此外,还探讨了YLLIP2的回用性,经过20批次的重复利用,固定化YLLIP2仍然保持80%的初始活力。从固定化BCL催化大豆油与乙醇转酯反应制备生物柴油,在30%叔丁醇反应系统(w/w),醇油摩尔比4:1,反应温度45℃下,生物柴油得率达84.9%,经10批次的重复利用,酶活几乎不降低,生物柴油得率维持在80%从上。 关键词:磁性纳米颗粒论文 生物信息学论文 定向固定化论文 反胶束论文 解脂耶氏酵母脂肪酶LIP2论文 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶论文 鱼油论文 富集论文 生物柴油论文
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    摘要4-7

    Abstract7-12

    主要缩写词12-14

    1 绪论14-44

    1.1 脂肪酶的性质14-16

    1.2 脂肪酶的运用16-20

    1.3 提升脂肪酶催化性能的办法和途径20-24

    1.4 脂肪酶的固定化24-41

    1.5 本探讨的目的作用41-44

    2 磁性纳米的合成及性能表征44-54

    2.1 材料与办法44-47

    2.2 结果与分析47-52

    2.3 讨论与小结52-54

    3 脂肪酶的生物信息学分析及特异固定化位点的确定54-74

    3.1 材料与办法54-59

    3.2 结果与分析59-71

    3.3 讨论与小结71-74

    4 G-MNPS固定化YLLIP2和BCL74-88

    4.1 材料与办法74-76

    4.2 结果与分析76-86

    4.3 讨论与小结86-88

    5 基于反胶束固定化系统的新型定向固定化探索88-108

    5.1 材料与办法88-89

    5.2 结果与分析89-100

    5.3 讨论与小结100-108

    6 固定化酶酶学性质探讨108-118

    6.1 材料与办法108

    6.2 结果与分析108-116

    6.3 讨论与小结116-118

    7 固定化脂肪酶的运用探讨118-129

    7.1 材料与办法118-120

    7.2 结果与分析120-126

    7.3 讨论与小结126-129

    8 全文总结与展望129-132

    8.1 全文总结129-130

    8.2 展望130-132

    致谢132-133

    参考文献133-156

    附录1 攻读学位期间发表论文目录156-158

    附录2 各种仪器和设备158

定54-743.1 材料与办法54-593.2 结果与分析59-713.3 讨论与小结71-744 G-MNPS固定化YLLIP2和BCL74-884.1 材料与办法74-764.2 结果与分析76-864.3 讨论与小结86-885 基于反胶束固定化系统的新型定向固定化探索88-1085.1 材料与办法88-895.2 结果与分析89-1005.3 讨论与小结100-1086 固定化酶酶学性质探讨108-1186.1 材料与办

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