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试析文蛤67kD层粘连蛋白受体及其调控通路在文蛤(Meretrixmeretrix)细胞生长和幼虫发育中的功能剖析学术论文模板

摘要:层粘连蛋白受体(laminin receptor, LR)是有着于细胞表面的跨膜糖蛋白,是介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间相互意义的一种非常重要的蛋白。LR通过与其配体层粘连蛋白(laminin, LN)的结合,构架了细胞同基膜间的信号传递通路,对胚胎早期发育、重要组织器官的形成从及维持生物体正常新陈代谢等生理活动中具有不可忽略的重要意义。目前,对层粘连蛋白受体从极为下游信号通路的探讨多集中于方式动物,在贝类等低等物种中探讨的很少。文蛤(Meretrix meretrix)是我国重要的养殖贝类,也是海洋双壳贝类的重要代表物种之一。本文从文蛤为实验对象,通过全长克隆获得了67kD LR基因(MmeLR)的全长cDNA序列,初步分析该基因的表达谱表明,其参与了文蛤的生长发育调控。在此基础上,进一步分别在细胞水平、幼虫阶段和成体阶段探讨了MmeLR极为调控通路对文蛤生长发育的调控机制,主要探讨结果详述如下:通过RACE以文蛤中获得了MmeLR的全长cDNA序列。将MmeLR基因进行原核重组表达,得到带有GST标签的重组蛋白rMmeLR,制备了兔抗多克隆抗体。通过realtime PCR和western blot对MmeLR的组织分布特点进行了探讨。使用far-western技术,验证了MmeLR极为配体层粘连蛋白(LN)间的相互意义,结果表明MmeLR和LN之间有着特异性相互意义。通过优化培养条件,可从稳定培养文蛤血细胞、外套膜和肝胰脏等组织的原代细胞达2-3周,并使之维持较高活力,为在细胞水平上进行基因功能验证等打下了基础。在文蛤原代培养细胞中,进一步探讨了MmeLR的功能。从matrigel(主要成分为LN)包被培养皿培养的文蛤外套膜细胞,在12h和24h时MmeLR的mRNA和蛋白表达量显著低于对照组,提示了LR在调控通路中的重要意义;同时,凋亡指示基因bcl-2和P53的mRNA表达量在试验组和对照组也有明显差别,进一步验证了MmeLR在细胞凋亡中的意义。制备了MmeLR的双链RNA(dsRNA)和siRNA(small interference RNA)并在文蛤原代细胞中进行了干扰办法探讨,沉默效率可从达到60%;制备了LR-pEGFP-N1和LR-pEGFP-ie1两种质粒,在人HeLa细胞系和昆虫SF9细胞系中进行了转染实验,结果显示可从稳定检测到EGFP阳性信号。在文蛤原代细胞中,对几种质粒进行了转移条件的探索,包括电穿孔法、脂质体转染法等。在文蛤幼虫发育历程中,通过realtime PCR和western blot对MmeLR在文蛤幼虫不同发育阶段的表达谱进行了探讨,利用免疫荧光技术分析了MmeLR在文蛤幼虫的时空分布,表明其参与了幼虫的发育。利用MmeLR的siRNA对文蛤幼虫进行了干扰实验,并对其下游调控通路进行了初步分析。对MmeLR下游分子钙调蛋白(MmeCAM)、钙调蛋白激酶IV(MmeCAMKIV)进行了全长克隆和表达谱探讨,并利用CAM抑制剂三氟拉嗪(TFP)对MmeCaM在文蛤幼虫发育历程中的意义进行了分析。从上探讨部分阐明了LR基因极为调控通路在贝类细胞生长和幼虫发育中的意义,结合建立的贝类细胞原代培养技术、RNAi和基因过表达技术,将为海洋无脊椎动物功能基因的分析验证和功能剖析提供新的探讨平台。 关键词:层粘连蛋白受体论文 钙调蛋白论文 文蛤论文 幼虫论文 基因功能探讨论文
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    致谢4-6

    摘要6-8

    Abstract8-14

    第1章 文献综述14-39

    1.1 层粘连蛋白受体相关探讨14-17

    1.1.1 层粘连蛋白和层粘连蛋白受体的概念14-15

    1.1.2 层粘连蛋白受体的分类及特点15-16

    1.1.3 67 kD 层粘连蛋白受体的功能16-17

    1.1.4 67 kD 层粘连蛋白受体的探讨近况17

    1.2 67 kD 层粘连蛋白受体下游信号通路上的相关基因17-22

    1.2.1 67 kD 层粘连蛋白受体介导的信号通路17-18

    1.2.2 钙调蛋白18-20

    1.2.3 钙调蛋白激酶极为调控的信号通路20-21

    1.2.4 钙调蛋白调控的细胞内信号通路21-22

    1.3 RNA 干扰和基因过表达技术在功能基因探讨中的运用22-28

    1.3.1 RNAi 的概念和意义机制22-24

    1.3.2 RNAi 的几种模式24

    1.3.3 RNAi 在功能基因验证中的运用24-25

    1.3.4 基因过表达极为意义模式25-26

    1.3.5 基因过表达的运用26-27

    1.3.6 海洋无脊椎动物原代细胞培养极为在功能基因验证中的运用27-28

    1.4 海洋双壳贝类幼虫发育极为分子调控机制28-32

    1.4.1 海洋双壳贝类的幼虫发育史29-30

    1.4.2 贝类幼虫发育历程中关键事件的分子调控30-32

    1.5 细胞凋亡32-37

    1.5.1 细胞凋亡的特点33

    1.5.2 细胞凋亡的信号通路33-36

    1.5.3 凋亡相关基因 bcl-2 和 p5336-37

    1.6 本探讨的目的和作用37-39

    第2章 67 kD 层粘连蛋白受体极为下游信号通路上的相关基因的克隆和序列分析39-57

    2.1 引言39-40

    2.2 实验材料与办法40-45

    2.2.1 实验材料40-41

    2.2.1.1 实验动物40

    2.2.1.2 实验所用引物40

    2.2.1.3 实验所用试剂配制40-41

    2.2.1.4 实验所利用主要仪器和设备41

    2.2.2 实验办法41-45

    2.2.2.1 总 RNA 的提取及反转录 cDNA 的合成41-42

    2.2.2.2 MmeLR 基因的全长 cDNA 的克隆42-44

    2.2.2.3 MmeCaM 和 MmeCaMKIV 基因的 cDNA 的克隆44

    2.2.2.4 序列分析44-45

    2.3 实验结果45-55

    2.3.1 文蛤层粘连蛋白受体(MmeLR)的 cDNA 序列分析和进化分析45-48

    2.3.1.1 MmeLR cDNA 的序列分析45-46

    2.3.1.2 MmeLR 的进化分析46-48

    2.3.2 文蛤钙调蛋白(MmeCaM)的克隆和序列分析48-52

    2.3.2.1 MmeCaM cDNA 的序列分析48

    2.3.2.2 MmeCaM 的进化分析48-52

    2.3.3 文蛤钙调蛋白激酶(MmeCaMKIV)的克隆和序列分析52-55

    2.3.3.1 MmeCaMKIV cDNA 的序列分析52-53

    2.3.3.2 MmeCaMKIV 的进化分析53-55

    2.4 讨论55-57

    第3章 MmeLR 在文蛤细胞粘附和凋亡中的功能分析57-78

    3.1 引言57-58

    3.2 实验材料与办法58-66

    3.2.1 实验材料58-62

    3.2.1.1 实验动物58

    3.2.1.2 实验所用引物58-59

    3.2.1.3 实验所用试剂配制59-62

    3.2.1.4 实验所利用主要仪器和设备62

    3.2.2 实验办法62-66

    3.2.2.1 文蛤外套膜原代细胞培养办法62

    3.2.2.2 层粘连蛋白的免疫荧光染色62

    3.2.2

细胞中,进一步探讨了MmeLR的功能。从matrigel(主要成分为LN)包被培养皿培养的文蛤外套膜细胞,在12h和24h时MmeLR的mRNA和蛋白表达量显著低于对照组,提示了LR在调控通路中的重要意义;同时,凋亡指示基因bcl-2和P53的mRNA表达量在试验组和对照组也有明显差别,进一步验证了MmeLR在细胞凋亡中的意义。制备了MmeLR的双链RNA(dsRNA)

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