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分析脾脏铝致大鼠淋巴细胞凋亡的线粒体/Caspase依赖性途径机制论文结论
法观察淋巴细胞的凋亡形态;流式细胞术检测细胞凋亡指数;琼脂糖凝胶电泳法检测DNA ladder;JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位(Δψm);Western blot检测胞浆内细胞色素C(CytC)蛋白表达量;分光光度法检测Caspase3和Caspase9的活性;实时荧光定量PCR法检测Bcl-2、Bax、Caspase3和Caspase9基因mRNA表达水平。旨在研究铝致大鼠脾脏淋巴
摘要:从体外培养Wistar大鼠脾脏淋巴细胞为探讨对象,在培养系统中分别添加终浓度为0(对照组,GC)、0.30(低剂量组,GL)、0.61(中剂量组,GM)和1.21(高剂量组,GH)mmol/L的三氯化铝(AlCl3·6H2O)。采取AO/EB双荧光染色法观察淋巴细胞的凋亡形态;流式细胞术检测细胞凋亡指数;琼脂糖凝胶电泳法检测DNA ladder;JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位(Δψm);Western blot检测胞浆内细胞色素C(CytC)蛋白表达量;分光光度法检测Caspase3和Caspase9的活性;实时荧光定量PCR法检测Bcl-2、Bax、Caspase3和Caspase9基因mRNA表达水平。旨在研究铝致大鼠脾脏淋巴细胞凋亡的线粒体/Caspase依赖性途径,结果表明:1荧光显微镜下可见,GC脾脏淋巴细胞呈绿色的圆形或椭圆形,染铝组均有绿色固缩状早期凋亡细胞、橘红色固缩状晚期凋亡细胞和橘红色圆形或椭圆形坏死细胞。染铝组脾脏淋巴细胞早期凋亡指数与晚期凋亡指数均明显升高,说明铝可诱导大鼠脾脏淋巴细胞凋亡。2DNA ladder分析表明,GC脾脏淋巴细胞无梯形条带出现,染铝组脾脏淋巴细胞均出现典型的DNA梯形带,说明铝可致大鼠脾脏淋巴细胞DNA损伤。3染铝组脾脏淋巴细胞红绿荧光比例明显低于GC,表明铝可引起大鼠脾脏淋巴细胞Δψm下降,导致脾脏淋巴细胞线粒体损伤。4染铝组脾脏淋巴细胞胞浆中CytC蛋白表达量显著增多,说明铝可诱导淋巴细胞线粒体内CytC释放,而产生细胞毒性意义。5染铝组脾脏淋巴细胞内Caspase3、Caspase9活性及mRNA表达量均明显高于GC,说明铝可引发脾脏淋巴细胞Caspase级联反应产生细胞毒性。6染铝组脾脏淋巴细胞Bcl-2、Bax mRNA表达量均升高,Bcl-2/Bax值随染铝浓度增大而升高,表明铝可通过诱导凋亡基因表达调控淋巴细胞凋亡。上面陈述的结果说明,铝可通过线粒体/Caspase依赖性途径导致大鼠脾脏淋巴细胞凋亡。本探讨结果可丰富铝免疫毒理学资料,为铝免疫毒性的预防奠定论述基础。 关键词:铝论文 大鼠论文 脾脏淋巴细胞论文 细胞凋亡论文 线粒体/Caspase依赖性途径论文
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    摘要8-9

    Abstract9-11

    1 前言11-15

    1.1 铝的免疫体系毒性11-12

    1.2 铝与细胞凋亡12-14

    1.2.1 铝与细胞凋亡线粒体途径12

    1.2.2 铝与细胞凋亡形态12-13

    1.2.3 铝与 DNA 损伤13

    1.2.4 铝与线粒体损伤13

    1.2.5 铝与 Caspase 家族13-14

    1.2.6 铝与 Bcl-2 蛋白家族14

    1.3 探讨目的和作用14-15

    2 材料与办法15-20

    2.1 主要仪器与材料15-16

    2.1.1 主要仪器15

    2.1.2 主要试剂15-16

    2.2 大鼠脾脏淋巴细胞提取及样品处理16

    2.2.1 脾脏淋巴细胞的提取16

    2.2.2 脾脏淋巴细胞培养和处理16

    2.3 检测项目与办法16-19

    2.3.1 脾脏淋巴细胞 AO/EB 染色观察16-17

    2.3.2 脾脏淋巴细胞凋亡指数的检测17

    2.3.3 脾脏淋巴细胞 DNA 损伤的检测17

    2.3.4 脾脏淋巴细胞ΔΨm 的检测17

    2.3.5 脾脏淋巴细胞胞浆内 CytC 蛋白表达的检测17

    2.3.6 脾脏淋巴细胞 Caspase 3、Caspase 9 活性的检测17

    2.3.7 脾脏淋巴细胞 Bcl-2,Bax,Caspase 3、9 基因 mRNA 表达检测17-19

    2.4 实验数据的分析及统计19-20

    3 结果与分析20-27

    3.1 脾脏淋巴细胞 AO/EB 双荧光染色的结果20-21

    3.2 脾脏淋巴细胞凋亡指数的检测结果21

    3.3 脾脏淋巴细胞 DNA ladder 的检测结果21-22

    3.4 脾脏淋巴细胞ΔΨm 的检测结果22

    3.5 脾脏淋巴细胞胞浆内 CytC 蛋白表达的检测结果22-23

    3.6 脾脏淋巴细胞 Caspase 3,9 活性极为 mRNA 表达的检测结果23-25

    3.6.1 脾脏淋巴细胞 Caspase 3,Caspase 9 活性的检测结果23-24

    3.6.2 脾脏淋巴细胞 Caspase 3、Caspase 9 基因 mRNA 表达检测结果24-25

    3.7 脾脏淋巴细胞 Bcl-2、Bax 基因 mRNA 表达的检测结果25-27

    4 讨论27-32

    4.1 染铝对脾脏淋巴细胞凋亡形态的影响27

    4.2 染铝对脾脏淋巴细胞凋亡指数的影响27-28

    4.3 染铝对脾脏淋巴细胞 DNA 损伤的影响2

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