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探讨质粒Cpn0308真核表达载体的构建及对小鼠免疫功能的影响毕业论文格式
双酶切的pcDNA 3.1/His A质粒用T4连接酶经行连接;对重组质粒做PCR检测,琼脂糖凝胶电泳、EcoR V限制性内切酶内切、BamH I/Not I双酶切、BamH I单酶切、碱基序列测定确定重组质粒正确性。序列测定证实载体中插入片度与GeneBank登录的肺炎衣原体AR39株Cpn0308基因一致,证明成功构建pcDNA3.1/His A-Cpn0308真核表达重组体。确定
摘要:肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia, Cpn)是一类严格的活细胞内寄生的、具有独特生活周期的微生物。Cpn复制及其生物合成是在包涵体中进行的,由此包涵体是衣原体赖以存活和繁殖的微环境。包涵体膜蛋白在肺炎衣原体发育及其致病历程中起重要作用。本课题构建肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308真核表达载体重组质粒(pcDNA3.1/His A-Cpn0308),鉴定构建成功后转染Hela细胞。确定能否在真核细胞内表达,并通过间接免疫荧光技术检测其表达结果;将重组质粒腹腔注射小鼠一定时间后观察小鼠免疫反应变化,期望增强小鼠对肺炎衣原体免疫防御能力,以期为进一步探讨Cpn0308免疫保护性奠定基础。首先取AR39株肺炎衣原体基因组,PCR扩增得到特异性Cpn0308基因,酚/氯仿抽提后经限制性内切酶BamH I和Not I双酶切,与同样双酶切的pcDNA 3.1/His A质粒用T4连接酶经行连接;对重组质粒做PCR检测,琼脂糖凝胶电泳、EcoR V限制性内切酶内切、BamH I/Not I双酶切、BamH I单酶切、碱基序列测定确定重组质粒正确性。序列测定证实载体中插入片度与GeneBank登录的肺炎衣原体AR39株Cpn0308基因一致,证明成功构建pcDNA3.1/His A-Cpn0308真核表达重组体。确定表达载体成功构建后,将pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒用热休克法转化制备好的感受态细菌E.cop XL1-Blue,筛选阳性克隆后扩大培养,提取质粒,再用Lipofector阳离子脂质体转染试剂将pcDNA3.1/His A-Cpn0308转染进本实验室培养传代的HeLa细胞。间接免疫荧光法检测到pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒转染的HeLa细胞胞浆有黄绿色荧光目的蛋白,空质粒转染对照组和空细胞对照组无荧光,证明构建的真核表达载体能够在体外真核细胞中表达目的蛋白。最后用pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒免疫4-5周龄BALB/C小鼠,一定时间后检测小鼠免疫反应变化。大量提取重组质粒,设置对照组(pcDNA3.1/His A质粒组、PBS组),分别于第0、14、28天对小鼠进行三次基因免疫(腹腔注射免疫、100μg/只),末次免疫两周后取血,分离并保存血清,Western blotting检测血清Cpn0308抗体特异性,间接ELISA策略检测小鼠血清中Cpn0308 IgG抗体水平、ELISA试剂盒检测细胞因子(IFN-γ,IL-4),检测小鼠免疫反应变化。重组质粒组血清抗体A 450 x±s为0.343±0.024,pcDNA3.1/His A质粒组为0.174±0.018,PBS组为0.156±0.023,WB结果显示重组质粒组小鼠血清稀释800倍后仍有特异性目的条带出现,对照组不出现;pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒组小鼠IFN-γ浓度均值为264ng·L~(-1),IL-4浓度均值为22ng·L~(-1),pcDNA3.1/His A质粒组为:IFN-γ120ng·L~(-1),IL-4 10ng·L~(-1),PBS组为:IFN-γ99ng·L~(-1),IL-4 9ng·L~(-1),结果显示pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒组IgG抗体水平和细胞因子水平显著升高,与pcDNA3.1/His A质粒对照组和PBS组对照组有统计学差别(P<0.05)。说明用pcDNA3.1/HisA-Cpn0308重组质粒对小鼠进行基因免疫后能增强小鼠的体液免疫和细胞免疫功能,为进一步探讨Cpn DNA疫苗以及探讨该蛋白的生物学功能提供实验基础。 关键词:肺炎衣原体论文 Cpn0308论文 真核表达论文 DNA疫苗论文 免疫反应论文
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pn0308基因一致,证明成功构建pcDNA3.1/His A-Cpn0308真核表达重组体。确定表达载体成功构建后,将pcDNA3.1/His A-Cpn0308重组质粒用热休克法转化制备好的感受态细菌E.cop XL1-Blue,筛选阳性克隆后扩大培养,提取质粒,再用Lipofector阳离子脂质体转染试剂将pcDNA3.1/His A-Cpn0308转染进本实验室培养传代的HeLa细胞。间接免疫荧

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