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论质粒SP-B-C/A(-18)基因多态性与高氧肺损伤易感性联系毕业论文致谢词范文
子活性高于A等位基因;(2)pGL4.17重组质粒荧光素酶活性高于pGL3-basic重组质粒,是后续探讨SP-B基因转录调控更好的选择;(3) SP-B-C/A (-18)多态性亦以体内水平影响SP-B基因转录。第二部分高氧对SP-B-C/A(-18)启动子活性调控意义探讨探讨高氧暴露下SP-B-C/A(-18)多态性对SP-B启动子活性的调控并研究相关机制。(1)将H441细胞随机
摘要:第一部分SP-B-C/A(-18)多态性对SP-B基因转录活性的调控[目的](1)构建人SP-B基因启动子(包含-18C/A多态性位点)荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-basic/pGL4.17-C/A,分析并对比其在H441细胞中的转录活性;(2)探讨SP-B-C/A(-18)多态性对足月儿外周血单个核细胞(PBMs)中SP-B mRNA水平的影响。[办法](1)从人基因组DNA (SP-B-C/A (-18)基因型为AC)为模板,PCR扩增SP-B启动子(-218/+435bp)序列片段,通过TA克隆办法连接到pGM-T载体上,筛选阳性克隆并将目的片段测序。将测序鉴定正确的-18位点分别为C和A的目的片段克隆到荧光素酶表达载体pGL3-basic上构建pGL3-basic-C/A重组质粒,酶切及测序鉴定重组质粒;(2)将构建的pGL3-basic-C/A重组质粒酶切改造,SP-B启动子片段被克隆到pGL4.17载体上构建pGL4.17-C/A重组质粒,经酶切及基因测序鉴定重组质粒;(3)采取脂质体法将构建的两种重组质粒分别和内参质粒pRL-TK同时转染H441细胞,转染24h后运用双荧光素酶检测体系检测细胞裂解液中萤火虫荧光素酶(firefly)及海肾荧光素酶(renilla)活性,两者比值间接反映启动子活性;(4)收集于2012年1月至2012年12月入住华中科技大学同济医学院附属同济医院新生儿重症监护室(NICU)的50例足月新生儿外周血样本,提取外周血基因组DNA进行SP-B-C/A(-18)基因分型,同时提取外周血PBMs中总RNA,实时定量PCR检测PBMs中SP-B mRNA水平,对比SP-B-C/A (-18)不同基因型PBMs中SP-B mRNA表达水平。[结果](1)构建的重组质粒pGL3-basic/pGL4.17-C/A经酶切及测序鉴定完全正确,-18位点碱基分别为C和A;(2)pGL3-basic-C、pGL3-basic-A重组质粒的firefly/renill比值分别为2.97±0.14、2.25±0.09,显著高于空白质粒载体pGL3-basic (0.20±0.06)(P0.01),说明构建的pGL3-basic-C/A重组质粒在H441细胞中具有启动子活性;pGL3-basic-C的firefly/renilla比值高于pGL3-basic-A (P0.01);(3) pGL4.17-C、 pGL4.17-A重组质粒的firefly/renilla比值分别为66.46±3.83、47.50±3.06,显著高于空白质粒载体pGL4.17(4.30±0.44)(P0.01),说明构建的pGL4.17-C/A重组质粒在H441细胞中具有启动子活性;pGL4.17-C的firefly/renilla比值高于pGL4.17-A (P0.01);(4) SP-B-C/A (-18)基因型为CC足月儿PBMs中SP-B mRNA水平明显高于AA基因型者(P0.01),基因型AC者表达水平亦明显高于AA(P0.01),基因型CC和基因型AC无显著差别(P0.05)。[结论](1)成功构建具有SP-B基因转录活性的pGL3-basic/pGL4.17-C/A重组质粒,SP-B-C/A (-18)多态性影响SP-B基因启动子活性,C等位基因启动子活性高于A等位基因;(2)pGL4.17重组质粒荧光素酶活性高于pGL3-basic重组质粒,是后续探讨SP-B基因转录调控更好的选择;(3) SP-B-C/A (-18)多态性亦以体内水平影响SP-B基因转录。第二部分高氧对SP-B-C/A(-18)启动子活性调控意义探讨[目的]探讨高氧暴露下SP-B-C/A(-18)多态性对SP-B启动子活性的调控并研究相关机制。[办法](1)将H441细胞随机分为2组:常氧组(21%O2/5%CO2)和高氧暴露组(95%O2/5%CO2),1)实时定量PCR检测两组细胞4h、8h、12h和24h4个时间点H441细胞SP-B mRNA表达水平,蛋白免疫印迹(Western Blot)检测12h、24h和48h3个时间点H441细胞SP-B蛋白表达水平;2)分别提取6h、12h和24h3个时间点两组H441细胞全细胞蛋白和核蛋白,

的firefly/renill比值分别为2.97±0.14、2.25±0.09,显著高于空白质粒载体pGL3-basic (0.20±0.06)(P0.01),说明构建的pGL3-basic-C/A重组质粒在H441细胞中具有启动子活性;pGL3-basic-C的firefly/renilla比值高于pGL3-basic-A (P0.01);(3) pGL4.17-C、 pGL4.17-A重组质粒的firefly/renilla比值分别为66.46±3.83、47.50±3.06,显著

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