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研究病毒猪圆环病毒2型的分子流行病学及病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达毕业论文致谢词范文

摘要:猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是无囊膜单股环状负链DNA病毒,基因组大小约为1.76kb,根据PCV的基因组成以及其抗原性不同可将其分为两种基因型,即猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type1,PCV1)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)。PCV1最初是以污染的猪肾传代细胞(porcine kidney-15cells,PK-15)上分离得到的一种广泛有着且无致病性的动物病毒。PCV2是由Elps等首次以断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning MultisystemicWasting Sydrome,PMWS)病猪体内分离到,已证明是PMWS的主要病原,自1991年加拿大首次爆发PMWS以来,其他国家和地区也相继报道PMWS的传播与发生。PCV2可能还是其他疾病,如猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、增生性坏死性肺炎、先天性振颤等的相关病原。1、为了解PCV2分子流行病学变化走势,本实验室于2008-2011年间以福建、江西、广东、安徽、浙江、河南、河北、广西壮族自治区、内蒙古自治区、上海、江苏和山西共12个省(市、区)的健康猪群和发病猪群共采集452份样品,对其进行PCV2检测,结果显示,452份样品中,有354份样品检测为PCV2阳性,感染率高达78.3%。通过扩增、克隆和测序共获得31株PCV2ORF2基因编码序列,比对浅析结果表明,31株PCV2均为PCV2b基因亚型,其中有21株归类于PCV1A/1B基因亚群,而9株为PCV1C亚群。对31株PCV2ORF2编码氨基酸序列比对浅析表明PCV2基因亚型及亚群具有其特异的氨基酸变异位点,这对于临床上区别PCV2亚型及亚群具有一定的指导作用。以基因水平上来说,自2008年以来我国以PCV1A/1B亚群为主要流行株,但值得我们关注的是,PCV1C亚群毒株以无到有并有逐渐增加的走势,并将来可能在PCV2的流行毒株中占据主要地位。2、本探讨运用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码PCV1A/1B的ORF2基因经昆虫细胞 子偏爱性优化后人工合成,然后将其插入供体质粒pFastBac~(TM)ⅠPPH启动子制约下的多克隆位点,将构建质粒转化至DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得了重组穿梭杆粒rBacmid-cap和rBacmid-opt-cap,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,通过间接免疫荧光证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得表达。通过荧光定量PCR策略测定上清中病毒拷贝数来选择获得最高滴度的扩增条件。通过蛋白印迹法测定不同表达时间和感染复数(Mutippcity of infection, M.O.I)值条件下细胞中目的蛋白表达量,确定目的蛋白的最佳表达条件。结果表明,目的蛋白在昆虫细胞中实现了表达,并可以装配成病毒样颗粒(Virus-pkeparticles, VLPs),直径约为17纳米。与野生型基因相比,经过 子优化的PCV1A/1B ORF2基因在昆虫细胞中的表达水平得到提升。以M.O.I值为0.05感染昆虫细胞后在96h条件下可以收获最高滴度的重组杆状病毒,以M.O.I值为5.0表达48h可以获得最佳的目的蛋白表达量。病毒样颗粒的表达与表达条件的优化,能够为PCV2基因工程疫苗的开发打下扎实的基础。 关键词:猪圆环病毒2型论文 流行病学论文 病毒样颗粒论文 蛋白表达论文
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    摘要6-7

    Abstract7-15

    第一章 绪论15-32

    1.1 猪圆环病毒病原学15-18

    1.1.1 猪圆环病毒的基因组结构15-16

    1.1.2 猪圆环病毒主要编码蛋白的结构与功能16-18

    1.2 猪圆环病毒的分类18-19

    1.3 猪圆环病毒 2 型的流行病学19-23

    1.3.1 猪圆环病毒 2 型的流行概况19-20

    1.3.2 猪圆环病毒 2 型流行毒株的变化20-22

    1.3.3 PCV2 的传播22-23

    1.4 PCV2 感染引起的疾病23-24

    1.5 PCVAD 的发病机理24-25

    1.6 PCVAD 相关致病因素25-28

    1.6.1 PCV2 的动态感染25-26

    1.6.2 饲养管理26

    1.6.3 宿主因素26

    1.6.4 病原的混合感染26-27

    1.6.5 免疫调节27-28

    1.7 PCV2 的疫苗探讨近况28-31

    1.7.1 原型疫苗28-29

    1.7.2 商品化疫苗29-31

    1.8 本探讨的立题依据与探讨作用31-32

    第二章 2008-2011 年中国部分地区猪圆环病毒 2 型的分子流行病学调查32-45

    2.1 材料和策略32-36

    2.1.1 样品采集32-33

    2.1.2 主要菌株、试剂、载体33

    2.1.3 样品处理及DNA的提取33

    2.1.4 引物设计33

    2.1.5 样品中PCV2的检测33-34

    2.1.6 部分阳性样品PCV2 ORF2全序列的扩增34

    2.1.7 PCV2 ORF2 序列的克隆与鉴定34-35

    2.1.8 序列的测定与浅析35-36

    2.2 实验结果36-43

    2.2.1 样品 PCV2 的 PCR 检测结果36-37

    2.2.2 采集样品的 PCV2 感染统计结果37-38

    2.2.3 部分阳性样品的 PCV2 ORF2 核苷酸序列浅析38-39

    2.2.4 部分阳性样品的 PCV2 ORF2 氨基酸序列浅析39-43

    2.3 讨论43-45

    第三章 猪圆环病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达45-65

    3.1 材料和策略45-55

    3.1.1 细胞、菌株与抗体45

    3.1.2 载体与质粒45

    3.1.3 主要试剂与主要仪器设备45-46

    3.1.4 目的基因的扩增46

    3.1.5 杆状病毒转移载体的构建与鉴定46-49

    3.1.6 重组穿梭杆粒 rBacmid-cap 和 rBacmid- opt-cap 的构建与制备49-50

    3.1.7 P1代重组杆状病毒的获得50-51

    3.1.8 P2代重组杆状病毒的扩增、鉴定及滴度测定51-52

    3.1.9 重组杆状病毒扩增条件的优化52-53

    3.1.10 目的蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达鉴定及表达量的比较53-55

    3.1.11 目的蛋白在Sf9昆虫细胞中表达条件的优化55

    3.1.12 猪圆环病毒PCV1A/1B VLPs的电镜观察55

    3.2 结果55-63

    3.2.1 PCV1A/1B ORF2基因 子的优化55-56

    3.2.2 PCV1A/1B野生型和 子优化型ORF2基因片段的扩增56

    3.2.3重组转移质粒的酶切鉴定56-57

    3.2.4 重组穿梭载体的PCR鉴定57

    3.2.5 P2代重组杆状病毒的滴度测定和PCR鉴定57-58

    3.2.6 重组杆状病毒扩增条件的优化58-59

    3.2.7 P3 代重组杆状病毒的扩增和滴度测定59

    3.2.8 间接免疫荧光检测目的蛋白的表达59-60

    3.2.9 SDS-PAGE和Western-blotting检测60-61

    3.2.10 目的蛋白在Sf9昆虫细胞中表达条件优化结果61-62

    3.2.11 猪圆环病毒PCV1A/1B病毒样颗粒的电镜观察62-63

    3.3 讨论63-65

    第四章 全文结论65-66

    参考文献66-83

    附录83-84

    致谢84-85

    作者简历85

1.6.1 PCV2 的动态感染25-261.6.2 饲养管理261.6.3 宿主因素261.6.4 病原的混合感染26-271.6.5 免疫调节27-281.7 PCV2 的疫苗探讨近况28-311.7.1 原型疫苗28-291.7.2 商品化疫苗29-311.8 本探讨的立题依据与探讨作用31-32第二章 2008-2011 年中国部分地区猪圆环病毒 2 型的分子流行病学调查32-452.1 材料和策略32-362.1.1 样

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