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简谈蜕皮双酰基肼类化合物初筛选系统的建立本科毕业论文评语
的初筛选模型。探讨结果如下:1.使用RT-PCR技术分别获得了长度为1149bp的EcR目的片段和1062bp的USP的目的片段,目的片段包含EcR、USP结构域中的C域(DNA结合域DNA-binding domain,DBD)、D域(铰链域hinge region)、E域(配体结合域pgand-bind domain,LBD),经氨基酸多重序列比对证明目的片段与鳞翅目的其它昆虫有非常高的同源性。
摘要:昆虫的蜕皮和变态受蜕皮激素和保幼激素的严格制约。蜕皮激素通过与蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)形成的异源二聚体相互意义,起动包括转录因子表达在内的级联反应,以而引起昆虫的蜕皮和变态。双酰基肼类杀虫剂模拟昆虫蜕皮激素功能,与蜕皮激素受体蛋白互相意义且难于分离,阻碍相关基因的表达,影响多种酶的活性,以而持续诱导蜕皮反应使虫体早熟蜕皮而死亡。多种昆虫蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的成功克隆为建立基于昆虫蜕皮激素受体的双酰基肼类杀虫剂高通量筛选技术奠定了基础。在细菌、酵母、昆虫细胞系中表达的EcR和USP蛋白,无论其粗提液,还是纯化蛋白,均可用于活性筛选。本探讨克隆了斜纹夜蛾(鳞翅目)EcR和USP功能域基因,灰飞虱(同翅目)EcRcDNA全长,采取原核表达技术获取纯化蛋白,建立双酰基肼类杀虫剂(先导化合物)的初筛选模型。探讨结果如下:1.使用RT-PCR技术分别获得了长度为1149bp的EcR目的片段和1062bp的USP的目的片段,目的片段包含EcR、USP结构域中的C域(DNA结合域DNA-binding domain,DBD)、D域(铰链域hinge region)、E域(配体结合域pgand-bind domain,LBD),经氨基酸多重序列比对证明目的片段与鳞翅目的其它昆虫有非常高的同源性。成功构建原核表达载体pEHISEGFPTEV-EcR|_(cde)和pEHISEGFPTEV-USPcde,表达载体经诱导纯化获得EcR、USP功能域蛋白。目的蛋白从包涵体形式分泌,分子量约为67kD和64kD与论述大小相符。2.运用自主优化的RACE技术,克隆了灰飞虱的EcR基因全长cDNA序列(GenBank序列号为JQ031549),全长3403bp,编码阅读框1521bp,编码506个氨基酸;成为NCBI基因库中第一个同翅目害虫EcR全长序列,构建灰飞虱EcR基因原核表达载体pEHISEGFPTEV-EcR|_(cde)-H。实验选取鳞翅目、鞘翅目、双翅目的7种昆虫的EcR基因的E域进行氨基酸比对,寻找多处氨基酸差别位点。3.采取放射性配基法,从斜纹夜蛾pEHISEGFPTEV-EcR|_(cde)、pEHISEGFPTEV-USPcde原核表达载体诱导蛋白为基础,建立了一套双酰基肼类杀虫剂(先导化合物)的简易初筛选模型。 关键词:蜕皮激素受体论文 超螺旋蛋白论文 原核表达论文 蛋白纯化论文 放射性配基法论文
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    中文摘要8-9

    Abstract9-10

    1 前言10-29

    1.1 斜纹夜蛾的发生、危害及防治10-12

    1.1.1 斜纹夜蛾的发生与危害10

    1.1.2 斜纹夜蛾的综合防治10-12

    1.2 灰飞虱的发生、危害及防治12-13

    1.2.1 灰飞虱的发生与危害12-13

    1.2.2 灰飞虱的综合防治13

    1.3 双酰基肼类杀虫剂意义机制13-18

    1.3.1 昆虫蜕皮激素的分子机理13-15

    1.3.2 双酰基肼类杀虫剂毒理机制15-17

    1.3.3 双酰基肼类杀虫剂抗性机制17-18

    1.4 昆虫蜕皮激素受体和超气门蛋白探讨发展18-24

    1.4.1 昆虫蜕皮激素受体结构和功能18-20

    1.4.2 超气门蛋白功能与空间结构20-21

    1.4.3 蜕皮激素与 EcR、USP 意义模式21-24

    1.5 探讨昆虫蜕皮激素受体和超气门蛋白的作用24-26

    1.6 实验办法简介26-28

    1.6.1 序列比对和体系进化分析26-27

    1.6.2 蛋白的原核表达27-28

    1.7 本探讨的目的作用28-29

    2 材料与办法29-45

    2.1 供试试剂、菌株和主要仪器29-32

    2.1.1 供试试剂29

    2.1.2 供试菌株、培养基29-30

    2.1.3 主要仪器30-31

    2.1.4 引物设计31-32

    2.2 供试虫源32-33

    2.3 总 RNA 的提取33-35

    2.3.1 实验预准备33-34

    2.3.2 Trizol 法提取总 RNA34

    2.3.3 RNA 质量检测34-35

    2.4 斜纹夜蛾目的基因片段克隆及表达载体构建35-39

    2.4.1 cDNA 第一链的合成35

    2.4.2 EcR、USP 目的片段克隆35-37

    2.4.3 重组质粒鉴定37-38

    2.4.4 序列分析38

    2.4.5 重组质粒、原核表达载体双酶切38-39

    2.4.6 表达载体连接、转化39

    2.5 灰飞虱 EcR cDNA 全长克隆及原核表达体系的建立39-42

    2.5.1 cDNA 第一链的合成39-40

    2.5.2 EcR 中间目的片段克隆40

    2.5.3 3'RACE40-41

    2.5.4 5'RACE41

    2.5.5 序列分析41

    2.5.6 原核表达体系构建41-42

    2.6 蛋白的表达和纯化42-44

    2.6.1 表达重组载体转化42

    2.6.2 目的基因的诱导表达42-43

    2.6.3 融合蛋白的纯化43-44

    2.7 不同药剂(或化合物)初筛选体系的建立44-45

    2.7.1 标记配基[3H]-PonA 浓度的确定44

    2.7.2 不同药剂(或化合物)初筛选体系的建立44-45

    3 结果与分析45-61

    3.1 总 RNA 提取质量检测45

    3.1.1 紫外分光光度法检测45

    3.1.2 琼脂糖凝胶电泳法检测45

    3.2 斜纹夜蛾目的基因片段克隆及表达载体构建45-53

    3.2.1 巢式 PCR 结果检测45-46

    3.2.2 重组质粒 PMD18-T-EcRcde、PMD18-T-USPcdePCR 鉴定46

    3.2.3 EcR、USP 目的片段克隆测序结果及分析46-52

    3.2.4 表达重组质粒 pEHISEGFPTEV-EcRcde、pEHISEGFPTEV-USPcde鉴定52-53

    3.3 灰飞虱目的基因片段克隆及表达载体构建53-58

    3.3.1 编码灰飞虱 EcR 的 cDNA 全长序列及氨基酸序列53-55

    3.3.2 灰飞虱 EcR 基因分析55-58

    3.3.3 灰飞虱 EcR 原核表达载体构建58

    3.4 蛋白的表达和纯化58-59

    3.5 不同药剂(或化合物)初筛选体系的建立59-61

    3.5.1 标记配基[3H]-PonA 浓度的确定59-60

    3.5.2 不同药剂(或化合物)初筛选体系的建立60-61

    4 讨论61-65

    4.1 RNA 提取及检测61-62

    4.2 目的基因片段克隆及表达载体构建62-63

    4.3 目的蛋白纯化63-64

    4.4 药剂(或化合物)初筛选体系的建立64-65

    5 结论65-66

    参考文献66-75

    致谢75-76

    硕士期间发表论文状况76

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