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阐释乳酸菌基于乳酸菌自身分泌蛋白的组成型强启动子探测及功能如何写论文
H-pPG612/L.cose/表达蛋白的分泌上清鉴定44-453.8 实时荧光定量PCR检测结果45-474 讨论47-504.1 二维聚丙烯安凝胶电泳对乳酸菌分泌蛋白的分离鉴定474.2 生物信息学办法在启动子预测中的运用47-484.3 荧光定量PCR办法在基因工程检测方面的运用484.4 构建得到的乳酸菌组成型启动子分泌表达载体的运用及展望48-505 结论50-51致
摘要:乳酸菌(lactic acid bacteira^LAB)是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类革兰氏阳性,无芽孢的细菌的总称。目前乳酸菌至少可从分为18个属,共200多种,除少数外,其中大多数是机体内必不可少且具有重要生理功能的菌群,广泛有着于肠道中,对增强肠道功能,改进肠道环境发挥着重要意义。因乳酸菌是益生菌,是一种食品安全级微生物,由于乳酸菌的这种特性与生理功能上的意义,在早期的食品工程添加方面和近期的生物工程和制药领域,乳酸菌也成为在抑菌、表达外源蛋白和口服免疫方面值得探索的新兴宿主菌属。高效的启动子序列可提升乳酸菌表达外源蛋白的水平,强启动子一般状况下会转录出大量mRNA,后经过翻译,产生大量目的蛋白,基于这种状况,本实验拟通过对乳酸菌自身分泌的蛋白进行检测分析,筛选出高表达量的无需诱导的组成型分泌表达蛋白的启动子序列,用于乳酸菌表达载体的构建,获得外源蛋白在乳酸菌中的高效表达。通过对干酪乳杆菌分泌上清总蛋白的二维电泳分析,质谱测序,找到了干酪乳酸菌分泌上清中天然分泌的量最大的蛋白质为肽聚糖水解酶(Peptidoglycan hydrolase),进一步以美国国立生物技术中心数据库(NCBI)中找到其在干酪乳杆菌中的编码序列和上游调控序列,用适用于原核启动子预测的软件BDGP Neural Network Promoter Prediction对肽聚糖水解酶基因上游约2000bp这段序列进行分析预测,最终确定了肽聚糖水解酶基因上游522bp作为其启动子区域,之后用SignalP4.0软件对肽聚糖水解酶的氨基酸序列进行分析,找到了其信号肽序列为前31个氨基酸。再通过设计带特定酶切位点的特异性引物,以干酪乳杆菌基因组中扩增出肽聚糖水解酶启动子及信号肽的核酸序列,通过酶切连接到己切除自身启动子的乳酸菌表达载体pPG612上构建成检测插入序列是否具有启动子活性的质粒PPH-pPG612,后电转化到干酪乳杆菌体会态中,培养鉴定后检测报告基因gusA的表达状况。为了同时验证实验中找到的启动子是否为强启动子,同样通过设计特异性引物以干酪乳杆菌基因组中克隆了己知的强启动子,乳酸脱氢酶(Lacotse dehydrogenase)启动子,构建质粒LDH-pPG612,电转化干酪乳杆菌,同样办法检测报告基因的表达状况。将重组干酪乳杆菌PPH-pPG612/L.casei和LDH-pPG612/L.casei分别扩大培养48小时,离心获得培养上清,经透析袋和TCA办法50倍浓缩后进行SDS-PAGE配置和Western blot分析,观察到重组干酪乳杆菌PPH-pPG612在80kD处出现特异性目的条带,说明预测的肽聚糖水解酶522bp片段在干酪乳杆菌宿主中具有组成型启动子活性并且同时克隆的信号肽序列也发挥了分泌功能。本实验中除了定性的检测gusA的表达状况,为了对比肽聚糖水解酶启动子、乳酸脱氢酶启动子和载体自身的诱导型木糖启动的强弱,对具有三种不同启动子质粒的宿主菌进行培养,超声破碎菌液,提取总RNA后去DNA,再进行反转录,将得到的cDNA作为模板,设计适用于荧光定量PCR的特异性引物,从质粒自身的氯霉素抗性基因为内参基因,根据得到的CT值计算三种启动子的效率为肽聚糖水解酶启动子:乳酸脱氢酶启动子:诱导型木糖启动子为0.55:0.22:1以而确定通过本实验用到的办法,我们克隆了一种组成型的强启动子,并且同时具有弓丨导外源蛋白分泌的信号肽序列. 关键词:二维聚丙烯酰胺凝胶屯泳技术论文 启动子探测载体论文 肽聚糖水解酶论文 荧光定量PCR论文
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    摘要8-10

    Abstract10-12

    1 前言12-22

    1.1 乳酸菌极为特性12-14

    1.1.1 乳酸菌的种类及主要功能特性12-13

    1.1.2 乳酸菌基因组学探讨发展13-14

    1.1.3 乳酸菌是作为基因工程受体菌的运用价值14

    1.2 乳酸菌基因工程的载体质粒14-16

    1.2.1 乳酸菌表达载体的构成15

    1.2.2 乳酸菌表达载体的类型15-16

    1.3 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的原理及运用16-17

    1.4 启动子的生物信息学预测和分析17-18

    1.5 启动子克隆办法探讨发展18-20

    1.5.1 基因组文库筛选法18

    1.5.2 启动子探针型载体筛选法18-19

    1.5.3 使用PCR技术克隆启动子19-20

    1.6 本探讨的作用及目的20-22

    2 材料与办法22-39

    2.1 材料22-25

    2.1.1 菌株禾口质粒载体22

    2.1.2 实验动物22

    2.1.3 主要生化试剂22

    2.1.4 二维聚丙烯酸胺凝胶电泳所用试剂22-23

    2.1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂23

    2.1.6 免疫印迹(Western-blot)主要试剂23

    2.1.7 培养基23

    2.1.8 主耍试验仪器与设备23-24

    2.1.9 引物合成24-25

    2.2 实验办法25-39

    2.2.1 GUS蛋白的多克隆抗体制备25-29

    2.2.2 表达GUS蛋白重组干酪乳杆菌的构建29-35

    2.2.3 表达产物的SDS-PAGE分35-36

    2.2.4 表达产物的Western-blot鉴36

    2.2.5 启动子转录强度的荧光定量PCR分36-39

    3 结果与分析39-47

    3.1 GUS蛋白多克隆抗体的制备39-40

    3.1.1 重组表达载体pCold-gusA的鉴定39

    3.1.2 重组大肠杆菌的诱导表达蛋白的鉴定39-40

    3.1.3 重组蛋白的表达形式分析40

    3.1.4 间接ELISA检测免疫兔血清抗体效价结果40

    3.2 干酪乳杆菌分泌上清的二维电泳银染及挖点蛋白的质谱结果40-42

    3.3 PCR扩增启动子序列PPH和LDH的结果42

    3.4 重组质粒pMD18-T-PPH/LDH的鉴定结果42-43

    3.5 干酪乳杆菌表达载体PPH-pPG612与LDH-pPG612的构建与鉴定43-44

    3.6 目的蛋白表达鉴定结果44

    3.7 重组干酪乳杆菌PPH-pPG612/L.cose/表达蛋白的分泌上清鉴定44-45

    3.8 实时荧光定量PCR检测结果45-47

    4 讨论47-50

    4.1 二维聚丙烯安凝胶电泳对乳酸菌分泌蛋白的分离鉴定47

    4.2 生物信息学办法在启动子预测中的运用47-48

    4.3 荧光定量PCR办法在基因工程检测方面的运用48

    4.4 构建得到的乳酸菌组成型启动子分泌表达载体的运用及展望48-50

    5 结论50-51

    致谢51-52

    参考文献52-57

    附录57-61

    攻读硕士学位期间发表的学术论文61

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