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谈淡色淡色库蚊miRNA表达谱及其与抗药性联系论文格式模板下载
TR 和 pMIR-REPORT-MUT 载体构建73-754.4 双荧光报告检测75-77讨论77-84小结84-85参考文献85-90综述90-103参考文献99-103攻读学位期间发表文章状况103-104致谢104              
摘要:蚊媒病是全世界重要的传染病之一,包括疟疾,西尼罗河热等严重危害人类健康的疾病。蚊媒病制约的主要措施是治理蚊媒。化学防治因其速杀、长效、方便等特征,一直是蚊媒综合治理对策中的主要办法。然而随着杀虫剂连续、大量的利用,蚊媒抗药性开始产生和进展。蚊媒抗药性产生和进展加剧了蚊媒病传播的恶化走势。化学防治因其能够快速,有效制约蚊媒种群,在从后很长的时间内仍是蚊媒治理的主要办法。由此蚊媒抗药性探讨仍是制约蚊媒病传播的重点。蚊媒抗药性机制包括3个主要方面。一方面是靶标抗性,即蚊媒杀虫剂靶位点的转变;另一方面代谢抗性,其涉及代谢相关酶类转录水平的变化;此外为生理抗性,如表皮转变影响杀虫剂的穿透性。其中,从代谢抗性探讨最多。前期代谢抗性探讨关注杀虫剂代谢相关酶活性的转变,未见抗性相关基因转录后调控的探讨。本实验初步探索了抗药性基因转录调控机制。miRNA是一类转录后调控的重要因子,广泛有着于动物和植物中。其通过降低mRNA表达或者抑制蛋白质合成参与调控体内近30%的基因。miRNA功能包括调节生物体的生长、发育、凋亡等。目前在蚊中已经开始探讨miRNA与抗感染方面的探讨,至今未见miRNA和杀虫剂联系的报道。本探讨选取在我国分布广泛的重要家栖性病媒蚊种淡色库蚊为探讨对象,从近年我国利用最多的卫生杀虫剂溴氰菊酯为材料,采取solexa测序法,对比了溴氰菊酯敏感和抗性淡色库蚊miRNA表达谱;通过PCR、T-A克隆及测序验证了pre-miRNA;采取定量PCR进一步验证了敏感和抗性品系中miRNA表达差别;采取双荧光报告验证了miR-71可从调控杀虫剂代谢酶类CYP325BG3表达。本探讨主要结果如下:1通过WHO幼虫浸渍法建立了淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系,其LC50为0.85mg/L,敏感品系LC50为0.03mg/L,抗性系数为28.3。2利用solexa法对淡色库蚊溴氰菊酯敏感和抗性品系进行了成功的测序。送测序mRNA,敏感蚊混合样本浓度为670ug/ml, OD260/0D280为1.80;抗性蚊混合样本浓度为600ug/ml,OD260/0D280为1.83。经过琼脂糖凝胶电泳和安捷伦Bianalyzer检测,RNA完整性良好,测序结果中rRNA的比例小于40%。表明solexa测序结果良好,可从用于继续分析。3对测序得到的原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理,并统计sRNA序列长度分布,可从观测到20-23nt长度的序列所占比例高。将测序结果与最近缘致倦库蚊的基因组进行比对。将上面陈述的测序得到的序列(clean序列)按照rRNAetc known miRNA repeat exon intron的优先级顺序注释。在鉴定淡色库蚊miRNA的时候,根据致倦库蚊基因组序列,提取miRNA前体序列,进行二级结构分析。进一步用miRApgn软件将上面陈述的序列与miRBase比对,筛选出淡色库蚊成熟miRNA和预测新的miRNA。在淡色库蚊 鉴定保守miRNA85个,前体结构91个;新miRNA143个,前体结构209个。同时对比了淡色库蚊敏感和抗性品系中miRNA表达量的差别。4在淡色库蚊miRNA检测中,检测到miR-932、miR-980、miR-998、miR-999等昆虫特有miRNA;miR-1891、miR-1889和miR-2941等蚊特有miRNA。根据miRNA基因簇分析办法,设10K bp为miRNA基因之间排列的最大距离,共发现7个淡色库蚊miRNA簇,其中包括在昆虫中最常见的let-7、miR-125构成的miRNA簇。PCR鉴定了淡色库蚊pre-miRNA,T-A克隆测序了部分淡色库蚊pre-miRNA序列。测序结果显示,与致倦库蚊miRNA前体结构相比,淡色库蚊miRNA的茎部结构保守,而环部碱基突变对比常见。其为淡色库蚊和致倦库蚊的体系分类提供了一种新的可行性。5选取solexa测序后对比有统计学差别的miRNA和昆虫学探讨中已有功能报道miRNA进行定量验证。在敏感品系大部分发育阶段,miR-279-3p、miR-13、miR-989、miR-4448和miR-285的表达水平比抗性品系高;miR-317、miR-2b、miR-92a在抗性品系各发育阶段表达水平比敏感品系高。6靶标预测提示,CYP325BG3的3’UTR序列和miR-71可能有着相互意义。采取双荧光报告实验证实,miR-71和CYP325BG3之间确实有着相互意义。结果表明,miR-71可能通过调节CYP325BG3的表达水平参与淡色库蚊溴氰菊酯抗性。本探讨首次报告了淡色库蚊抗药性miRNA表达谱,PCR和T-A克隆测序验证了miRNA前体结构,定量PCR鉴定了抗药性相关miRNA。双荧光报告办法验证miR-71可从调控代谢酶类CYP325BG3的表达,进而参与杀虫剂抗性。探讨结果丰富了昆虫miRNA数据库,初步探索了miRNA在蚊抗药性中的意义,具有重要的论述作用和潜在的实际运用价值。 关键词:miRNA论文 淡色库蚊论文 溴氰菊酯论文 抗药性论文 miR-71论文
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    中文摘要4-7

    Abstract7-10

    前言10-13

    材料与办法13-40

    1 实验材料13-15

    1.1 供试蚊13

    1.2 细胞系13

    1.3 主要试剂13-14

    1.4 主要仪器设备14-15

    2 实验办法15-40

    2.1 淡色库蚊样本收集及小 RNA 测序15-19

    2.2 淡色库蚊 miRNA 鉴定及表达谱分析19-31

    2.3 miRNA 与目的基因相互意义的双荧光报告检测31-40

    结果40-77

    1 淡色库蚊 miRNAsolexa 测序40-56

    1.1 淡色库蚊抗性品系选育40

    1.2 淡色库蚊总 RNA 分离与鉴定40-41

    1.3 淡色库蚊敏感和抗性品系 miRNA 测序与生物信息学分析41-56

    2 淡色库蚊 miRNA 前体序列 pre-miRNA 鉴定56-60

    2.1 淡色库蚊前体序列 PCR 扩增56-59

    2.2 T-A 克隆部分 PCR 扩增的前体序列59-60

    3 定量 PCR 鉴定 miRNA 差别表达谱60-71

    3.1 部分 U6 序列 PCR 扩增及测序60-61

    3.2 miRNA 在淡色库蚊抗性和敏感品系各发育阶段的表达61-71

    4 双荧光报告检测 miR-71 与 CYP325BG3 的相互意义71-77

    4.1 CYP325BG3 在敏感和抗性品系雌蚊中表达水平71

    4.2 CYP325BG3 部分 3’UTR 序列扩增71-73

    4.3 pMIR-REPORT-UTR 和 pMIR-REPORT-MUT 载体构建73-75

    4.4 双荧光报告检测75-77

    讨论77-84

    小结84-85

    参考文献85-90

    综述90-103

    参考文献99-103

    攻读学位期间发表文章状况103-104

    致谢104

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