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探究再生仿刺参Apostichopusjaponicus(Selenka)消化道再生的组织细胞特点与关键基因毕业论文提纲
用251.4.2 探讨思路25-261.4.3 预期成果26-271.5 本章小结27-28第二章 仿刺参消化道再生的组织学和细胞学特点28-482.1 前言28-292.2 材料与办法29-312.2.1 样品的采集292.2.2 组织学观察29-302.2.3 免疫组化双标记302.2.4 透射电镜观察302.2.5 数据分析30-312.3 实验结果31-432.3.1 仿刺参消化道再生的形态学观察31-332.3.2
摘要:仿刺参是我国重要的海珍品,具有超强的再生能力,当环境不适或者遇到敌害时,可从通过吐脏将消化道等内脏几乎完全排出体外,当环境条件适宜时,又可从再生出功能完善的内脏器官。不同种类的海参吐脏模式不同,因而再生的方式也不完全相同。尽管如此,目前已知所有海参再生的探讨仍认为消化道是吐脏后第一个再生的器官。肠系膜为消化道再生的中心。目前的探讨多集中于组织学、细胞学方面,分子生物学方面仍需更多的努力。本论文使用组织学、免疫组化、高通量测序技术、RACE、实时定量等相关手段对仿刺参消化道再生机理的展开探讨。探索了仿刺参消化道再生的组织细胞学变化;建立了仿刺参再生转录组,改进了仿刺参再生探讨分子基础薄弱的近况;构建了连续的表达谱,揭示了仿刺参消化道再生的基因全局调控变化状况;获得并分析了关键再生基因wnt6、Hox6、HMG(High mobipty group protein)从及RAP(Regeneration associated protein)基因在消化道再生中的表达变化,并初步研究预测其意义。主要探讨结果如下:1.将仿刺参消化道再生历程划分为5个关键阶段:伤口愈合、原基形成、肠腔形成、肠道分化从及最后的生长阶段。超微结构观察发现再生早期的消化道具有显著去分化现象。新生肠壁的组织层早期只有浆膜层和粘膜下层,最终分化出浆膜层、肌肉层、粘膜下层和粘膜层。新生组织细胞的获得早期从迁移为主(变形再生),逐渐改变为增殖为主(新建再生)。2.使用454高通量技术构建仿刺参再生转录组,已经获得182473条Reads,这些EST拼接成71086个unigene,改进了海参再生方面分子基础过于薄弱的近况。将再生转录组与对照组对比分析发现:起结构功能活性意义的相关基因在再生库中出现的频数明显升高,而催化活性相关基因则明显降低。关键信号通路Wnt、 Notch信号通路等在再生历程中被激活。3.使用RNA-Seq技术构建了消化道再生连续的基因表达谱,揭示基因全局表达调控状况。消化道再生早期,基因的表达状况发生巨大变化,而随着新生消化道分化的完成逐步恢复到正常水平。证明仿刺参消化道再生是一个多基因调控的历程。特异性Go term”揭示了差别表达基因在再生的每个阶段主要形式的功能。除Ribosome和Sppceosome pathway等在再生中显而易见会被富集通路外,通路“Notch signapng pathway”,“ECM-receptor interaction”和“Cytokine-cytokinereceptor interaction”等也被明显富集,这些通路在仿刺参消化道再生中更加值得关注。4.获得了基因Wnt6和AjHBOX6(Hox6)的cDNA全长。使用Real-time PCR分析发现wnt6的表达量在消化道再生初期明显升高到后期逐渐开始下降恢复到正常水平,其可能通过激活许多基因来起始仿刺参的消化道再生。AjHbox6的表达量在消化道再生中后期开始明显升高而后逐渐下降,推测其在消化道再生中起指导前、中、后肠分化的意义。5.获得了基因RAP(Regeneration associated protein)和HMG(High mobiptygroup protein)的cDNA全长。RAP基因在消化道再生早期阶段表达量为正常生命活动下的400多倍。除囊舌虫外,该基因尚未在其它物种中发现有可能是特异性的再生基因。HMG是一类介导细胞迁移的重要调节因子,其表达在再生早期即发生上调。目前对于仿刺参消化道再生的探讨多关注于mRNA水平上的探讨,需进一步在蛋白水平和microRNA上进行探讨,分析调控网络结合RNA干扰、抗体阻断等技术分析关键基因功能,揭示仿刺参消化道再生机理。 关键词:仿刺参论文 Apostichopus论文 japonicus论文 消化道论文 再生论文 组织学论文 细胞学论文 转录组论文 表达谱论文 wnt基因论文 Hox基因论文 RAP基因论文 HMG基因论文
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    致谢4-11

    摘要11-13

    Abstract13-16

    第一章 海参消化道再生探讨发展16-28

    1.1 海参消化道的组织学特点16-17

    1.2 海参消化道再生的组织细胞学探讨发展17-22

    1.2.1 海参吐脏17-18

    1.2.2 海参消化道再生的基本方式18-19

    1.2.3 肠系膜为消化道再生的中心19

    1.2.4 再生组织细胞的起源19-21

    1.2.5 细胞分裂与细胞死亡对再生的意义21-22

    1.3 海参消化道再生的分子机制探讨发展22-25

    1.3.1 原基形成相关基因23

    1.3.2 肌细胞生成相关基因23-24

    1.3.3 再生中的癌症相关基因24-25

    1.4 本探讨的目的、作用及探讨思路25-27

    1.4.1 探讨的目的与作用25

    1.4.2 探讨思路25-26

    1.4.3 预期成果26-27

    1.5 本章小结27-28

    第二章 仿刺参消化道再生的组织学和细胞学特点28-48

    2.1 前言28-29

    2.2 材料与办法29-31

    2.2.1 样品的采集29

    2.2.2 组织学观察29-30

    2.2.3 免疫组化双标记30

    2.2.4 透射电镜观察30

    2.2.5 数据分析30-31

    2.3 实验结果31-43

    2.3.1 仿刺参消化道再生的形态学观察31-33

    2.3.2 仿刺参消化道再生的组织结构变化33-38

    2.3.3 仿刺参消化道再生的细胞增殖38-41

    2.3.4 仿刺参消化道再生的超微结构41-43

    2.4 讨论43-46

    2.4.1 仿刺参消化道再生方式43

    2.4.2 消化道原基的形成43-44

    2.4.3 细胞增殖与组织层分化44-45

    2.4.4 再生机制45-46

    2.5 本章小结46-48

    第三章 仿刺参再生转录组的构建48-66

    3.1 前言48-49

    3.2 材料与办法49-54

    3.2.1 样品的采集49

    3.2.2 RNA 提取与 cDNA 文库构建49-51

    3.2.3 454 高通量测序51

    3.2.4 454 高通量数据分析51

    3.2.5 Real-time PCR 验证差别表达基因51-54

    3.3 实验结果54-63

    3.3.1 454 测序、拼接与统计分析54-56

    3.3.2 GO 功能分类注释与 pathway 分析56-58

    3.3.3 差别表达基因分析58-61

    3.3.4 Real time PCR 验证61-63

    3.4 讨论63-65

    3.4.1 发育类基因64

    3.4.2 细胞外基质基因64-65

    3.4.3 细胞骨架基因65

    3.5 本章小结65-66

    第四章 仿刺参消化道再生表达谱的构建66-92

    4.1 前言66-67

    4.2 材料与办法67-70

    4.2.1 样品的采集67

    4.2.2 RNA 提取与 cDNA 文库构建67-68

    4.2.3 序列注释、测序评估与基因表达量计算68

    4.2.4 差别表达基因的筛选68

    4.2.5 GO (Gene ontology)和通路(Pathway)富集分析68

    4.2.6 Real-time PCR 验证68-70

    4.3 实验结果70-86

    4.3.1 RNA-Seq 测序结果统计70-72

    4.3.2 测序饱和度分析72

    4.3.3 差别表达基因(Differentially expressed genes, DEGs)72-76

    4.3.4 仿刺参消化道再生表达谱的 Real-time PCR 验证76-79

    4.3.5 差别表达基因的 GO 功能富集分析79-82

    4.3.6 差别表达基因的 Pathway 富集分析82-83

    4.3.7 个别基因的表达方式83-86

    4.4 讨论86-89

    4.4.1 DGEs 的 GO 功能分析87

    4.4.2 再生相关的通路87-88

    4.4.3 三类重要再生相关基因88-89

    4.5 本章小结89-92

    第五章 仿刺参 wnt6 及 Hox6 的克隆与表达分析92-108

    5.1 前言92-93

    5.2 材料与办法93-96

    5.2.1 样品的采集93

    5.2.2 RNA 提取和 cDNA 全长克隆93-95

    5.2.3 序列的生物信息学分析95

    5.2.4 Real-time PCR 基因表达与定量95-96

    5.2.5 数据分析96

    5.3 实验结果96-105

    5.3

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