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研讨肝素硫酸乙酰肝素3-O磺基转移酶V在大肠杆菌中的表达及其酶学性质论文范文

摘要:硫酸乙酰肝素3-氧-磺基转移酶V(3-OST-V)是生物酶法合成活性低分子肝素历程中的关键酶之一。作为一种双功能酶,它可以催化生成具有抗凝血活性的硫酸乙酰肝素,也可以催化生成能与I型单胞疱疹病毒糖蛋白D结合的多糖。本探讨对生物合成活性肝素历程中的关键酶3-OST-V在大肠杆菌中进行了异源表达,对其诱导表达条件进行了优化,并对表达产物进行了纯化及酶学性质的初步探讨,结果如下:通过PCR策略获得目的基因后,选用大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌和pET15b表达载体构建重组大肠杆菌BL21/pET15b/3-OST-V,并诱导表达得到重组蛋白3-OST-V,经SDS-PAGE检测目标蛋白的大小约为31kDa,经检测粗酶液的酶活力为0.11U/mg,表明成功表达了外源蛋白——硫酸乙酰肝素3-OST-V。对重组菌BL21/pET15b/3-OST-V诱导表达历程中的各单因素条件进行了优化,并进行了正交试验。结果表明:在以LB培养基为发酵培养基时,装液量为100mL,诱导表达时起始OD600为1.3,诱导剂IPTG终浓度为0.2mmol/L,诱导温度为20℃的条件下,诱导表达6h,重组蛋白3-OST-V粗酶液的酶活力提升到42.17U/mL。通过亲和层析法纯化重组蛋白3-OST-V,经测定纯化后的电泳纯产物比酶活达到0.58U/mg,较粗酶液的比酶活提升5.27倍,回收率为80.4%。在此基础上,对纯化后的3-OST-V的酶学性质进行了初步探讨。结果表明3-OST-V酶促反应的最适温度为35℃,温度在40℃以下时,酶的温度稳定性较好。3-OST-V酶促反应的最适pH为7.0,且在pH7.0~pH9.0条件下稳定性较好。在反应液中加入终浓度为1mmol/L的K~+、Ca~(2+)、Ba~(2+)对酶促反应有一定的推动作用。综合AST-IV和3-OST-V酶学性质的探讨结果,确定偶联测定3-OST-V活性的反应系统为:pH7.0,反应温度30℃,终浓度为1mmol/L的Ca~(2+)、Ba~(2+)。综上,本探讨对生物合成活性肝素历程中的一个关键酶3-OST-V进行了异源表达,对其诱导表达条件进行了优化,并对表达产物进行了纯化及酶学性质的初步探讨,为其大量生产奠定了一定的基础,以而为规模化合 工硫酸乙酰肝素提供必须的工具酶,并为人工合成硫酸乙酰肝素的反应系统奠定一定的基础。

起始OD600为1.3,诱导剂IPTG终浓度为0.2mmol/L,诱导温度为20℃的条件下,诱导表达6h,重组蛋白3-OST-V粗酶液的酶活力提升到42.17U/mL。通过亲和层析法纯化重组蛋白3-OST-V,经测定纯化后的电泳纯产物比酶活达到0.58U/mg,较粗酶液的比酶活提升5.27倍,回收率为80.4%。在此基础上,对纯化后的3-OST-V的酶学性质进行了初步探讨。结果

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